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    生防菌F170062發(fā)酵液理化性質(zhì)研究及粗提活性初探

    2018-04-04 01:48:15張曉慷王海利張新剛
    山東化工 2018年5期
    關(guān)鍵詞:提液灰霉病發(fā)酵液

    張曉慷,王海利,張新剛

    (山東省農(nóng)藥科學(xué)研究院,山東 濟(jì)南 250100)

    植物病害是影響農(nóng)作物高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的重要因素之一,每年因植物病害給農(nóng)作物造成的損失無法估量。我國是世界上人口最多的國家,防治植物病害,促進(jìn)農(nóng)作物增產(chǎn),保障糧食安全對我國具有十分重要的意義。傳統(tǒng)的植物病害防治措施以施用化學(xué)農(nóng)藥為主,但化學(xué)農(nóng)藥存在殘留污染、誘導(dǎo)病菌抗性增強(qiáng)、造成環(huán)境污染、危害人體健康等諸多缺點(diǎn)[1-2]。生物農(nóng)藥和生物防治以其低殘留、低毒、低抗性及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),逐漸被世界很多國家關(guān)注和推廣,成為解決植物病害最富前景的措施[3-4]。

    黃瓜灰霉病是由灰葡萄真菌侵染引起的,主要發(fā)生于黃瓜生育期的病害,若防治不當(dāng),一般會(huì)造成10%~70%以上的減產(chǎn),現(xiàn)已成為我國溫室大棚中黃瓜減產(chǎn)的主要病害之一[5-6]。同時(shí),該病菌還能危害茄子、番茄、大蔥、青椒、韭菜等多種經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物,所以,開發(fā)高效、低毒、可靠的灰霉病防治藥物具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

    本課題組從土壤中篩選到一株對黃瓜灰霉病具有生物防效的菌株F170062,本文對其發(fā)酵液的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究,同時(shí)對發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)的粗提活性進(jìn)行了初步探索。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1供試菌株

    供試菌株:生防菌株F170062,本實(shí)驗(yàn)室保存。

    靶標(biāo)菌株:黃瓜灰霉病菌,由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

    1.1.2培養(yǎng)基

    發(fā)酵培養(yǎng)基:1%可溶性淀粉、2%葡萄糖、2.5%花生粉、0.1%牛肉膏、0.4%的酵母浸粉、0.2%NaCl、0.005%K2HPO4,水1000 mL,調(diào)節(jié)pH值=7.2,分裝于250 mL三角瓶中,每瓶約80 mL,在121℃下濕熱滅菌25min備用。

    PDA培養(yǎng)基:37 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、1000 mL水,加熱煮沸溶解,分裝于500 mL三角瓶中,每瓶約300 mL,在121℃下濕熱滅菌25min備用。

    1.2 方法

    1.2.1發(fā)酵粗提液的制備

    取生長有F170062菌的斜面接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,在28℃,轉(zhuǎn)速220 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)4d。而后將發(fā)酵液在4000 r/min的離心機(jī)中離心10min,上清液經(jīng)0.22μm的濾膜過濾,作為發(fā)酵粗提液,置于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2發(fā)酵粗提液抑菌活性的測定

    采用有毒介質(zhì)法測定發(fā)酵粗提液對供試菌株的抑菌活性。(1)取20μL發(fā)酵粗提液加入到已滅菌的培養(yǎng)皿中;(2)在培養(yǎng)皿中定量加入20 mLPDA培養(yǎng)基,搖晃均勻;(3)待培養(yǎng)基凝固后,在培養(yǎng)基上接種黃瓜灰霉病菌餅,放置在18℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d,后取出采用十字交叉法測定病原菌菌落直徑,并計(jì)算抑菌率,公式如下:

    抑菌率=(對照菌落直徑-處理后菌落直徑)×100/(對照菌落直徑-菌餅直徑)

    如非特殊說明,本文所有試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

    1.2.3發(fā)酵粗提液粗提活性試驗(yàn)樣品處理

    將20 mL發(fā)酵粗提液平均分成3份,分別調(diào)pH值為3、7、10,后再將每個(gè)pH值發(fā)酵粗提液再分成3份,分別作正丁醇萃取,乙酸乙酯萃取、沸水15min加熱處理,萃取完成后,把有機(jī)相部分和水相部分進(jìn)行分離,對每個(gè)樣品進(jìn)行編號,編號如表1所示。

    表1 F170062粗提液樣品編號

    對處理后的樣品進(jìn)行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),蒸發(fā)掉各自的溶劑后向樣品中加入100μL甲醇,再加入與原發(fā)酵液同體積的水,恢復(fù)到原來的體積,同時(shí)回調(diào)到原發(fā)酵液pH值。

    1.2.4發(fā)酵粗提液粗提活性試驗(yàn)樣品紙片的制備

    在無菌室中,將濕熱滅菌處理過的紙片依次在樣品中浸取1~2min,后取出,按編號順序放置在含有黃瓜灰霉病菌孢子的PDA培養(yǎng)基,每個(gè)樣品重復(fù)兩次,以不放置處理樣品的含有黃瓜灰霉病孢子的PDA培養(yǎng)基為對照,在18℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d,后查看結(jié)果。

    1.3 粗提液穩(wěn)定性測定

    1.3.1熱穩(wěn)定性測定

    將發(fā)酵粗提液在30、50、70、90、100℃下水浴1 h,冷卻后,以未處理的發(fā)酵粗提液及無菌水為對照,測定對黃瓜灰霉病的抑菌活性。

    1.3.2酸堿穩(wěn)定性的測定

    測定發(fā)酵粗提液pH值后,用鹽酸和氫氧化鈉將粗提液pH值調(diào)節(jié)至2、4、6、8、10、12,在室溫下放置2 h,后將pH值調(diào)回粗提液原pH值,以未處理的發(fā)酵粗提液及無菌水為對照,測定對黃瓜灰霉病的抑菌活性。

    1.3.3紫外穩(wěn)定性的測定

    將發(fā)酵粗提液加入到無菌培養(yǎng)皿中,在超凈工作臺(tái)中,25W紫外燈下,距離10 cm照射1、3、5、7、9 h,以未處理的發(fā)酵粗提液及無菌水為對照,測定對黃瓜灰霉菌的抑菌活性。

    1.3.4粗提液加入量

    定量向培養(yǎng)基中加入10、20、50、100、150、200、300、400、500μL粗提液,以未處理的發(fā)酵粗提液及無菌水為對照,測定對黃瓜灰霉病的抑菌活性

    2 結(jié)果與分析

    2.1 粗提液的熱穩(wěn)定性

    將粗提液在30、50、70、90、100℃下水浴1 h,冷卻后以未處理的發(fā)酵粗提液和無菌水為對照測定抑菌活性,結(jié)果如表2所示。

    表2 F170062粗提液的熱穩(wěn)定性

    由表2可知,當(dāng)發(fā)酵粗提液在30℃、50℃下加熱1 h后,抑菌活性較原液相比并沒有發(fā)生明顯變化,但是當(dāng)溫度上升到70℃時(shí),溫度對粗提液中的抑菌物質(zhì)有明顯影響,此時(shí),對黃瓜灰霉病菌的抑菌率較未處理液降低了約10%,且隨著溫度的繼續(xù)升高,抑菌率呈明顯下降的趨勢。這說明,粗提液中的抑菌物質(zhì)在低溫下有較好的穩(wěn)定性,對黃瓜灰霉病菌能夠保持較強(qiáng)的抑制作用,但是在受熱溫度較高時(shí),抑菌物質(zhì)抑菌效果明顯變差,抑菌效果降低。

    2.2 粗提液的酸堿穩(wěn)定性

    將菌株F170062發(fā)酵粗提液在不同pH值條件下放置2 h后,調(diào)回原始的pH值,測定抑菌活性,結(jié)果如表3所示。

    表3 F170062粗提液的酸堿穩(wěn)定性

    由表3可知,F(xiàn)170062發(fā)酵粗提液在酸性和堿性條件下,其抑菌活性并沒有發(fā)生明顯變化,特別是在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿的環(huán)境中,其抑菌物質(zhì)的活性與未處理液相比,仍能保持較強(qiáng)的抑菌率。這說明,F(xiàn)170062粗提液的酸堿穩(wěn)定性較好,能夠適應(yīng)酸堿環(huán)境的變化。

    2.3 粗提液的紫外穩(wěn)定性

    無菌條件下將F170062發(fā)酵粗提液用25W紫外燈照射不同時(shí)間后測定抑菌活性,結(jié)果如表4所示。

    表4 F170062粗提液的紫外穩(wěn)定性

    如表4所示,經(jīng)紫外線照射1、3、5、7、9 h后,F(xiàn)170062發(fā)酵粗提液的抑菌活性與未處理液相比沒有發(fā)生顯著變化,這說明,F(xiàn)170062發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)有較強(qiáng)的紫外穩(wěn)定性。紫外穩(wěn)定性對抑菌物質(zhì)的開發(fā)與使用至關(guān)重要。農(nóng)藥的施用多在自然條件下進(jìn)行,如果抑菌物質(zhì)在紫外線照射下不穩(wěn)定,藥效就會(huì)顯著降低,影響農(nóng)藥的使用效果[7]。F170062發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)紫外穩(wěn)定性較好,有著良好的生物農(nóng)藥開發(fā)前景。

    2.4 粗提液投加量的影響

    無菌條件下,分別取10、20、50、100、150、200、300、400、500μL發(fā)酵粗提液于培養(yǎng)皿中,以無菌水為對照,通過有毒介質(zhì)法測定其抑菌活性,結(jié)果如表5所示。

    表5 F170062粗提液投加量的影響

    由表5可知,隨著F170062粗提液投加量的增加,對黃瓜灰霉菌的抑制率呈逐漸上升的趨勢,抑菌率從24.58%提升到92.50%,當(dāng)粗提液投加量增加到500μL時(shí),黃瓜灰霉病病菌已無法正常生長,這說明F170062發(fā)酵粗提液對黃瓜灰霉病菌有較好的抑菌效果。

    2.5 粗提液抑菌物質(zhì)粗提活性初探

    由于發(fā)酵粗提液中成分復(fù)雜,包括發(fā)酵液中未利用完的培養(yǎng)基組分和各種各樣的發(fā)酵代謝產(chǎn)物,所以為方便后期抑菌物質(zhì)的提取,采用紙片法探索抑菌物質(zhì)合適的提取方法,并對發(fā)酵液中的粗提活性進(jìn)行考察,其結(jié)果如圖1所示。

    圖1 F170062粗提液紙片法試驗(yàn)結(jié)果

    由圖1可知,編號為6、7、10、15、16紙片周圍都有明顯的抑菌圈,其中,6:pH值=7 正丁醇萃取相;7:pH值=7乙酸乙酯萃余相;10:pH值=10、正丁醇萃取相;15:pH值=10沸水處理;16:未處理粗提液。試驗(yàn)結(jié)果說明以上編號的紙片中含有F170062粗提液的抑菌物質(zhì)。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果可得出結(jié)論:(1)抑菌物質(zhì)在中性和堿性條件下能夠被正丁醇萃取出來;(2)抑菌物質(zhì)難以被乙酸乙酯萃取出來;(3)抑菌物質(zhì)在堿性條件下經(jīng)過沸水15min加熱處理后仍具有抑菌活性。

    3 結(jié)論

    通過對F170062菌發(fā)酵粗提液的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、紫外穩(wěn)定性、粗提液加入量的考察發(fā)現(xiàn),菌株F170062發(fā)酵粗提液在50℃以下有較好的抑菌效果,當(dāng)溫度高于70℃時(shí),發(fā)酵粗提液的抑菌活性開始下降,但是發(fā)酵粗提液經(jīng)100℃處理后仍有抑菌活性;發(fā)酵粗提液在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿的環(huán)境下和紫外輻照條件下具有較好的抑菌穩(wěn)定性,抑菌效果與未處理液相差不大;隨著發(fā)酵粗提液加入量的增大,抑菌物質(zhì)對黃瓜灰霉病菌的抑制能力呈逐漸增強(qiáng)的趨勢,當(dāng)發(fā)酵粗提液加入量增加到500μL時(shí),黃瓜灰霉病菌已經(jīng)無法生長了;通過紙片法對F170062發(fā)酵粗提液的粗提活性進(jìn)行初探發(fā)現(xiàn),在中性和堿性條件下發(fā)酵粗提液的抑菌物質(zhì)能夠被正丁醇萃取出來,這為以后F170062發(fā)酵粗提液中抑菌物質(zhì)的提取方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

    [1]丑波.黃瓜灰霉病的發(fā)生及防治[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè),2014(9):22.

    [2]齊愛勇,魏東盛,劉大群,等.番茄灰霉病拮抗細(xì)菌的篩選[J].植物保護(hù)科學(xué),2006,22(6):311-313.

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