凝集素的血凝監(jiān)測方法研究

重慶郵電大學生物醫(yī)學工程研究中心　夏　爽　陳仟仟　程　星　陸　偉　李章勇

0　引言

凝集素[1]是指一種從各種植物、無脊椎動物和高等動物中提純的糖蛋白或結合糖的蛋白。植物凝集素[2]對血紅細胞的凝集作用是很重要的一個功能，因此我們在這方面的研究顯得十分必要。

現(xiàn)凝集素的血液凝集實驗所采取的手段通常是用倍比稀釋法，此方法具有以下缺點：觀察者通過肉眼觀察，來判斷是否發(fā)生凝集反應以及反應效果的強弱。此方法判斷的結果往往因人而異、主觀性強、誤差率高。且肉眼無法記錄反應過程。因此迫切需要一種可以克服上述問題的方法，圖像處理技術為其提供了新方向。

目前，范一峰[3]等將OTSU算法和數(shù)學形體方法結合起來能夠有效的提取昆蟲的圖像；刁智華[4]等利用2G-R-B提取類病斑后進行二值化，再通過面積閾值分割法實現(xiàn)了棉花病葉害螨的圖像分割；員偉康等以新疆植物藥的花和葉作為研究對象，運用最大類間發(fā)篩選得到圖像分類的特征。殷曉麗[5]等人在凝集素的試驗中，采用的是“V”型板倍比稀釋或顯微鏡觀察法。但上述研究對凝集素的效價判斷主要還是利用肉眼觀察的方式，而圖像處理技術應用的場景也未曾涉及到凝集素對血液的試驗中來。本文以凝集素和血液的實驗樣品為研究對象，采用自動閾值選取的方法對實驗樣品中凝集和沉降區(qū)域進行二值化分割，并選取特征值分析變化情況來定量判斷和監(jiān)測實驗過程及結果，為今后科研工作者在凝集素的性質研究和觀察對比提供一種新的動態(tài)監(jiān)測方法。

1　監(jiān)測方法設計

1.1　濾波處理

采集的圖像受光照強度變化、實驗室工作人員走動等原因，都可能造成噪聲干擾。為了去除多余噪聲，采用中值濾波對每張圖像進行處理。中值濾波[6]是將每一個像素點的灰度值設為該點某鄰域中的所有像素點灰度值的中值，以此達到讓周圍像素值接近真實值，并且消除鼓勵噪聲點的效果。這種方法能夠較好的保持圖像的邊緣和紋理信息，結果如圖1所示。

1.2　圖像分割

觀察圖1中的灰度圖像，此處圖像的背景色調單一，針對這樣的圖像特點，采用閾值分割[7-10]算法來對圖像進行分割。由于實驗的血液樣本和凝集素濃度有變化，光照受外界條件影響等原因，圖像的灰度值存在差異，因此無法通過一個固定的閾值來進行分割，需采用一種能自動確定閾值的方法。

圖1　實驗結果灰度圖

1979年日本學者大津提出的基于類間方差最大化的分割算法，簡稱OTSU[11]。該算法簡單穩(wěn)定，一直被認為是分割閾值自動選取的最優(yōu)方法。首先根據(jù)需要處理的圖像特點，選取一個初始的閾值，把圖像分為兩個區(qū)域A和B,及分別為前景和背景；然后對兩個區(qū)域中的像素點進行數(shù)學運算，計算出兩個像素群的方差；這時讓初始閾值根據(jù)一定的法則進行有規(guī)律的變化，就能得到一系列的不同方差值；直到得到的類間方差與類內方差的比值最大的時候，就認為此刻所選用閾值最能使圖像分割得明顯，即得到最優(yōu)閾值[12]。類間方差的公式為：

其中A為目標區(qū)域，B為背景區(qū)域，是A區(qū)的平均灰度，是B區(qū)的平均灰度，而U為整幅圖像的平均灰度。和分別是A區(qū)域和B區(qū)域占整幅圖像的比例。分割結果如圖3所示。

圖2　閾值分割圖像

1.3　面積比值分析

圖2與原始圖像的對比不難發(fā)現(xiàn)，圖像二值化分割出的中心黑色區(qū)域與血液沉降到V型板底部所形成的區(qū)域的大小吻合度較高，說明OTSU算法的分割有效并具有很高準確性。而在實驗反應過程中，血細胞的懸浮狀態(tài)一直在改變，也就是V型孔中血液呈現(xiàn)出的紅色區(qū)域大小在隨時間改變。凝集的沉降和凝集的狀態(tài)與凝集素的作用大小密切相關，因此有必要對沉降區(qū)域的面積變化進行分析。基于此，以時間為橫坐標、二值化圖像中黑色部分面積占圖像總面積的百分比為縱坐標，計算數(shù)據(jù)，統(tǒng)計并進行分析。

1.4　度差分析

上述試驗中，實驗開始的一段時間后，血沉降的比例大小開始以一定的速率下降，并在一定時間內完成反應，達到穩(wěn)定狀態(tài)。然而在開始下降之前的一段時間，百分數(shù)的的圖像波動很大，其原因是剛開始實驗時，樣品與PHA混合均勻，整體呈現(xiàn)均勻的紅色狀態(tài)，而反應發(fā)生后要出現(xiàn)明顯效果需要一定的時間，這時候進行圖像的分割，閾值的自動選取容易出現(xiàn)誤差。在凝集素濃度較低時，凝集效果不明顯，容易造成對照實驗與實驗組的差異化不夠明顯。采用若單單只做一次實驗可能會被當成誤差忽視掉，因此需要新的算法來使得其差異化更加明顯。針對這一現(xiàn)象，設計了灰度差分析算法來表示實驗樣品直接的差異：計算灰度圖像中最大灰度值與最小灰度值得差值，以時間為橫坐標作圖分析。

2　監(jiān)測系統(tǒng)設計

2.1　材料制備

（1）BS溶液配置：調pH至7.2。

（2）菜豆凝集素（Phaseolus vulgaris agglutinin，以下簡稱PHA）：配成不同濃度的PHA凝集素溶液（1000、500、250、100、50、25ug/ml）。

（3）血液懸浮液配置：將全血與PBS溶液配置成體積分數(shù)為10、8、5%備用。

2.2　血凝集監(jiān)測實驗設計

根據(jù)每次的實驗設計要求，依梯度選取適當濃度的PHA溶液和三種不同體積分數(shù)的全血懸浮液，在96孔V型微量反應板上進行實驗。每組實驗組設置一組對照組，每孔50ul（25ul血液樣品+25 ul凝集素/25ulPBS）。在血凝板正上方架設攝像頭（高度一定，約為10cm），從所有試劑混合均勻開始拍攝，到血液與凝集素反應結束停止拍攝，時間約為1小時（凝集反應時間），每100s取一副圖像，流程如圖3所示。

圖3　動態(tài)監(jiān)測流算法流程圖

3　實驗驗證及結果分析

面積比值法—不同濃度凝集素作用分析：

選取五組濃度分別為1000、500、250、100、50ug/ml的PHA溶液，標識分別為F、E、D、C、B，同時設置一組不添加凝集素的作為陰性對照組，標識為A，在V型孔板上實驗，分析結果如圖4所示。

理論上：凝集素濃度越大，凝集的血細胞越多，則圖像分割的二值化圖像中值為0的區(qū)域占總面積的比例越大。圖4中：首先，對曲線平穩(wěn)的高度大小進行分析，高度由高到低正好是PHA濃度由高到低的順序，完全吻合，說明該數(shù)據(jù)分析結果對照組，B1、B2都加入了濃度僅為25ug/ml，C1、C2都加入了濃度為250ug/ml的PHA得到的實驗結果圖。計算灰度圖像中最大灰度值與最小灰度值得差值，以時間為橫坐標作圖分析，可得到圖5。

圖4　不同濃度凝集素檢測曲線

圖5　灰度差分析（橫坐標單位是100秒；縱坐標是灰度差大?。?/p>

此組實驗與圖4實驗設置相同，僅多增加了一組濃度為250ug/ml的PHA，重復實驗之間得到的結果的吻合度較高。同理，凝集效果越好，視頻圖像的變化越小，因此灰度差的變化越??；反之，差值變化越大，但最終差值都會趨于穩(wěn)定。圖5中的曲線與這一理論推測完全吻合。圖5中A、B、C三組實驗結果有明顯差異，特別是相比較與圖6中A與B之間的微小差距，圖5中A和C的曲線差距非常明顯。這樣的結果就可以排除圖4方法中可能將正確的實驗結果當成視為誤差的可能性，更好的對實驗結果做了區(qū)分，精確性更高。對比可知：此算法可對實驗過程進行有效監(jiān)測，并提高區(qū)分度和差異化，但反應時間的界定不如圖4方法準確。

4　討論與結論

本文研究對象主要是凝集素對血液作用的實驗，針對科研工作者在常用的V型孔板上進行實驗時采用肉眼直接觀察的弊端，提出了一種基于圖像處理技術的監(jiān)測方法，對血凝過程進行監(jiān)測，并對實驗結果進行有效分析。將拍攝的實驗視頻作為基礎，對其所得視頻進行中值濾波處理、OTSU閾值分割二值化等步驟，計算并分析其中面積比值大小變化規(guī)律和灰度差變化規(guī)律，得到監(jiān)測曲線。由本文實驗結果可知，面積分析法可以很好且直觀的反應出實驗過程中血液沉降的現(xiàn)象，并對反應的時間、速度做出準確判斷；并且可以根據(jù)最終穩(wěn)定所得值的大小進行定量的分析和對比；灰度差值分析算法可以在低濃度的實驗中，更有效的區(qū)分反應的效果差異。兩種分析算法并不矛盾，并且相互起到了補充增強的作用，在實驗中可以同時結合兩種分析方法對實驗過程進行監(jiān)測和分析，可以豐富實驗過程中的實驗數(shù)據(jù)、觀察到更為細致準確的實驗現(xiàn)象，排除人主觀因素的干擾。本文設計的基于面積分析法和灰度差變化監(jiān)測的方法為今后凝集素對血液的實驗觀察監(jiān)測提供了一種創(chuàng)新的新方向。

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