基于納米生物傳感器特異性檢測膽堿及其相關(guān)物質(zhì)

何少斌, 吳鋼偉, 王小龍*， 陳 偉

(1.泉州市傳染病防治醫(yī)院,福建泉州 362000;2.福建省立醫(yī)院,福建福州 350000;3.福建醫(yī)科大學(xué)納米醫(yī)學(xué)技術(shù)研究所,福建福州 350000)

膽堿(Choline)在人體內(nèi)能促進腦發(fā)育提高記憶力，特別是對嬰幼兒的大腦發(fā)育具有重要影響，它能保證信息傳遞，調(diào)控細胞凋亡，促進體內(nèi)轉(zhuǎn)甲基代謝等，且是構(gòu)成生物膜和卵磷脂的關(guān)鍵組成成分，是機體可變甲基的來源而作用于合成甲基的產(chǎn)物，又是乙酰膽堿(ACh)的前體[1 - 2]。膳食中的膽堿能增加神經(jīng)傳遞介質(zhì)乙酰膽堿的形成，有助于腦神經(jīng)信號的傳遞，因此膽堿作為營養(yǎng)成分常被添加到嬰兒奶粉等食品中[3 - 4]。乙酰膽堿能特異性地作用于各類膽堿受體，在組織內(nèi)能被膽堿酯酶(ChE)水解破壞，作用廣泛，對神經(jīng)系統(tǒng)，心血管系統(tǒng)及胃腸道都有明顯作用。腦內(nèi)的乙酰膽堿與認知活動，神經(jīng)信號的傳遞密切相關(guān)，研究認為體內(nèi)該物質(zhì)含量與阿爾茲海默病的癥狀改善顯著相關(guān)[5 - 6]。與乙酰膽堿密切相關(guān)的包括膽堿酯酶與膽堿酯酶抑制劑，膽堿酯酶能選擇性水解乙酰膽堿，參與細胞的發(fā)育和成熟，促進神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)再生，同時也是多種疾病的參考指標如青光眼、老年癡呆、重癥肌無力[7]。膽堿酯酶抑制劑通過對乙酰膽堿酯酶(AChE)的可逆性抑制，可以使乙酰膽堿在突觸處的積累，延長并且增加乙酰膽堿的作用，屬于間接擬膽堿類藥物，臨床主要用于治療重癥肌無力和青光眼及抗老年性癡呆。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，膽堿酯酶抑制劑被用于抑制昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)中乙酰膽堿酯酶的活性，從而使神經(jīng)元間傳導(dǎo)質(zhì)乙酰膽堿無法分解成膽堿和乙酸，阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)而使昆蟲致死，例如有機磷酸酯類和氨基甲酸酯類殺蟲劑[8]。

經(jīng)典的膽堿檢測方法如氣相色譜法、高效液相色譜法雖然在檢測準確性上占據(jù)優(yōu)勢，但需要批量的樣品、長時間的前處理過程以及昂貴的費用[9 - 10]。納米材料的發(fā)展為膽堿酯酶系統(tǒng)的研究提供了幫助，由于它們的穩(wěn)定性好、粒子粒徑較小、熔點高、催化活性好等使越來越多學(xué)者投入對納米材料的研究[11 - 20]。本文就近年來基于納米材料的特性檢測膽堿及其相關(guān)物質(zhì)的方法進行了總結(jié)分析。

2 基于納米材料模擬酶活性用于膽堿及其相關(guān)物質(zhì)測定

2.1 膽堿的測定

基于膽堿氧化酶(CHO/ChOx)構(gòu)建的檢測方法由于出色的特異性得到廣泛重視。Tseng等[21]發(fā)現(xiàn)由PDDA修飾的Fe3O4NPs在結(jié)合膽堿氧化酶后仍能保持模擬酶活性，在熒光底物AUR存在情況下，能夠催化其與H2O2生成熒光產(chǎn)物，膽堿氧化酶選擇性氧化膽堿生成H2O2，從而成功應(yīng)用到膽堿的檢測中，檢測限為20 μmol/L。由MnO2NPs修飾的電極對于H2O2有雙向電催化特性?；诖颂匦裕琗u等[22]將膽堿氧化酶和MnO2NPs修飾到玻碳電極上，成功應(yīng)用于膽堿的檢測，其線性范圍為1.0×10-5～2.1×10-3mol/L，該方法下的抗環(huán)血酸和尿酸沒有明顯的干擾作用。同樣，Kurochkin等[23]基于MnO2NPs的電化學(xué)特性，利用玻碳電極檢測了膽堿和膽堿酯酶，方法的線性范圍為1.3×10-7～1.0×10-4mol/L，檢測限為130 nmol/L?；诖朔椒z測丁酰膽堿酯酶，檢測限為5 pmol/L，同時檢測膽堿酯酶抑制劑毒死蜱，其檢測限為50 pmol/L。

Chen等[24]利用示差脈沖伏安法成功檢測了膽堿的含量，檢測線性范圍210 nmol/L～190 μmol/L，檢測限達180 nmol/L。Fe3O4NPs在被確證擁有過氧化物模擬酶活性后，由于制備簡易，催化活性高及磁性等特性一直獲得很大的關(guān)注度，除上述熒光法檢測膽堿，Yang等[25]利用Fe3O4NPs的過氧化物酶活性，將Fe3O4NPs和膽堿氧化酶修飾在金電極上，用電化學(xué)方法檢測膽堿，檢測限為0.1 nmol/L。綜合分析，在近年來的膽堿檢測中，納米生物傳感器得到較多的研究和關(guān)注，雖然材料穩(wěn)定性高，方法特異性好，部分方法檢測靈敏度高，但作者認為納米材料的催化活性在一定程度上仍不能完全替代天然酶，檢測方法的多樣性較為缺乏。另外，電化學(xué)納米生物傳感器的方法對操作要求較高。

2.2 乙酰膽堿的測定

乙酰膽堿作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)細胞中是由膽堿和乙酰輔酶A在膽堿乙酰移位酶的催化作用下合成的。由于乙酰膽堿缺乏電性、發(fā)色基團、熒光基團及可以交聯(lián)的基團，所以在檢測方法的研究上遇到了困難。除了經(jīng)典方法外，近年來常用酶法，即乙酰膽堿酯酶可以選擇性水解乙酰膽堿，能使乙酰膽堿水解成膽堿和乙酸，再通過膽堿氧化酶氧化膽堿乙酰膽堿生成H2O2，過氧化物酶可催化H2O2氧化過氧化物酶底物。Chang等[26]基于上述方法，利用Au/Ag NPs的高催化活性模擬過氧化物酶催化H2O2和底物AUR作用產(chǎn)生熒光信號，該體系檢測限低至0.21 nmol/L，線性范圍為1～100 nmol/L，此方法成功應(yīng)用于人體血樣的乙酰膽堿檢測中?；谏鲜鲱愃圃?Fe3O4NPs/還原性氧化石墨烯納米復(fù)合材料檢測系統(tǒng)檢測乙酰膽堿低至39 nmol/L,線性檢測范圍為0.1～1.0×104μmol/L[27]。在Au NPs熒光特性的研究過程中，發(fā)現(xiàn)H2O2能夠氧化Au-S鍵為有機二硫化物，導(dǎo)致熒光減弱，Chen[28]利用H2O2抑制BSA-Au NCs熒光檢測乙酰膽堿的含量，提供一種新型檢測乙酰膽堿的方法，檢測范圍為0.1～20 nmol/L，檢測限為5 pmol/L。同樣基于熒光特性，Mathew等[29]制備BSA為模板包被的Au NCs并交聯(lián)乙酰膽堿酯酶，利用該材料的熒光在與ACh混合后減弱特異性檢測ACh，檢測限低至10 nmol/L，線性范圍為10 nmol/L～6.4 μmol/L。He等[30]構(gòu)建了TOPS-4-AAP-BSA-PtNPs-H2O2顯色體系，利用紫外檢測法直接檢測嬰兒奶粉中的膽堿和血漿中的乙酰膽堿[31]，紫外吸光度與膽堿濃度在6～400 μmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢測限為2.5 μmol/L，乙酰膽堿的線性范圍為10～200 μmol/L，檢測限為2.84 μmol/L。該方法靈敏度高且能替代現(xiàn)有的方法進行檢測，該研究首次提出該材料的蛋白質(zhì)防污染特性，對材料的研究和體系的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)[30 - 31]。

2.3 膽堿酯酶的測定

對生物樣品中膽堿酯酶的研究由早期的海膽、兩棲動物、脊椎動物演變到人類全血。總膽堿酯酶分為真性膽堿酯酶和假性膽堿酯酶，真性膽堿酯酶(乙酰膽堿酯酶)主要存在于肌肉神經(jīng)接頭處水解乙酰膽堿，假性膽堿酯酶(丁酰膽堿酯酶)廣泛存在于神經(jīng)膠質(zhì)細胞、血漿、肝、腎、腸中。膽堿酯酶能夠參與細胞的發(fā)育和成熟，促進神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)再生，對生命體有著至關(guān)重要的作用，同時也是疾病的參考指標，例如測定血清膽堿酯酶活性是協(xié)助診斷有機磷中毒和評估肝實質(zhì)細胞損害的重要手段，通過研究乙酰膽堿酯酶及其抑制劑可進一步改善治療阿爾茲海默病。Qian等[32]利用DNA肽鏈模板化制備銀納米簇，并通過Ag-S能夠選擇性與巰基膽堿相結(jié)合從而提高Ag NCs的熒光，該方法選擇性檢測了巰基膽堿，其線性范圍為2.0～16 nmol/L，檢測限達0.3 nmol/L?；谏鲜鲈?，繼而檢測了乙酰膽堿酯酶活性，檢測限低至0.5×10-4U/mL，并成功用于人體紅細胞的檢測。丁酰膽堿酯酶又稱假性膽堿酯酶/血清膽堿酯酶，是由肝臟合成的一種非特異性酯酶，由于該酶在肝臟中合成后立即釋放到血漿中，因此血清中丁酰膽堿酯酶活性是測定肝細胞蛋白質(zhì)合成功能的靈敏指標，臨床常規(guī)檢查的即為此類酶，肝臟發(fā)生實質(zhì)損害時此酶合成減少。量子點是準零維的納米材料，由少量的原子所構(gòu)成，基于上述材料，Chen等[33]合成了兩種量子點，并分別基于熒光增強和熒光抑制兩種方法檢測了丁酰膽堿酯酶，其檢測線性范圍分別為10～1 000 U/mL和10～2 000 U/mL。此方法還驗證了血清中丁酰膽堿酯酶的檢測，為今后檢測提供基礎(chǔ)。

2.4 膽堿酯酶抑制劑的測定

膽堿酯酶抑制劑可作為抗膽堿酯酶藥,臨床主要用于治療重癥肌無力和青光眼及抗老年性癡呆。膽堿酯酶抑制劑能夠抑制昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)中乙酰膽堿酯酶的活性，使神經(jīng)元間傳導(dǎo)質(zhì)乙酰膽堿無法分解成膽堿和乙酸，阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)而使昆蟲致死。在過去的數(shù)十年里，膽堿酯酶抑制劑的研究不斷發(fā)展，并且成功開發(fā)多種類型的抑制劑。隨著人們對膽堿酯酶及抑制劑構(gòu)效關(guān)系的深入研究，其合成和檢測方法得到飛速發(fā)展。Yan等[34]用酶法替代經(jīng)典氣質(zhì)和液質(zhì)聯(lián)用，利用Fe3O4NPs優(yōu)秀的模擬過氧化物酶活性催化H2O2與TMB顯色檢測有機磷，提供一種快速且直觀的檢測方法。有機磷選擇性抑制乙酰膽堿酯酶的活性使乙酰膽堿不能水解和氧化生成H2O2，從而阻止TMB的顯色。此法成功檢測神經(jīng)藥物沙林、農(nóng)藥巴拉奧松和高滅磷，其檢測限分別為1、10和5 000 nmol/L。Wang等[35]基于石墨烯修飾Ag NPs，利用電化學(xué)方法成功檢測農(nóng)藥毒死蜱和西維因，檢測限分別為5.3×10-14和5.45×10-13mol/L。Upadhyay等[36]建立一個電化學(xué)伏安法結(jié)合酶法檢測膽堿酯酶抑制劑，該法基于Au/Pt NPs，成功檢測農(nóng)藥對氧磷、神經(jīng)藥物沙林和滅線磷，線性范圍分別為150～200、40～50和40～60 μmol/L。除上述光學(xué)和電化學(xué)方法，Li等[37]制備變性牛血清白蛋白包被的Au NCs，利用乙酰膽堿酯酶對碘代硫代乙酰膽堿的水解，生成可猝滅Au NCs熒光的硫代膽堿，成功利用熒光猝滅方法檢測了乙酰膽堿酯酶，線性范圍為0.005～0.15 U/mL，檢測限為0.02 mU/mL，該方法成功應(yīng)用于人體血清中乙酰膽堿酯酶的檢測。

3 展望

納米材料研究領(lǐng)域的學(xué)者們已構(gòu)建多種方法制備具有各種結(jié)構(gòu)和功能的納米材料，實驗證明，納米材料具有優(yōu)秀的催化活性、高穩(wěn)定性、高特異性，以及經(jīng)濟和規(guī)?；苽涞膬?yōu)勢，所構(gòu)建的生物傳感器在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化工、食品、農(nóng)業(yè)和環(huán)境等領(lǐng)域的應(yīng)用研究已應(yīng)運而生。本文涉及的關(guān)鍵物質(zhì)膽堿及其相關(guān)物質(zhì)，作為神經(jīng)中樞疾病相關(guān)指標，對其檢測關(guān)系到人體的認知功能，相關(guān)疾病的發(fā)病機制和治療方案等諸多領(lǐng)域。本研究收集了近年來涉及納米材料在膽堿及其相關(guān)物質(zhì)的檢測，其目的旨在對已經(jīng)發(fā)表的研究進行綜合地分析討論，且希望能供后來的學(xué)者參考，以推動納米材料在醫(yī)藥檢驗方面的發(fā)展。隨著納米技術(shù)的深入、優(yōu)化和更新，新型的納米生物傳感器將層出不窮，鑒于納米材料的多方面優(yōu)勢，其開發(fā)和研究擁有廣闊的發(fā)展前景。

參考文獻：

[1] Blusztajn J K.Science,1998,281:794.

[2] Zeisel S H.Nutrition,2000,16:669.

[3] Zeisel S H.J Am Coll Nutr,2004,23:621.

[4] Zeisel S H.J Pediatr,2006,149:131.

[5] Khachaturian Z S.Archives of Neurology,1985.

[6] Ellman G L,Diane C K,Andres J V,Featherstone R M.Elsevier,1961,7:88.

[7] Lepage L,Schiele F,Gueguen R,Slest G.Clinical Chemistry,1985,4,31:546.

[8] Liu Y,Wei M.Elsevier,2014,49.

[9] Szilagyi P I A,Schmidt D E,Green J P.Anal Chem,1968,40:2009.

[10] Koc H,Mar M H,Ranasinghe A,Swenberg J A,Zeisel S H.Anal Chem,2002,74:4734.

[11] Song Y J,Qu K G,Zhao C,Ren J S,Qu X G.Adv Mater,2010,22:2206.

[12] Jv Y,Li B X,Cao R.Chem Commun,2010,46:8017.

[13] Wang S,Chen W,Liu A L,Hong L,Deng H H,Lin X H.Chem Phys Chem,2012,13:1199.

[14] Andre R,Natalio F,Humanes M,Leppin J,Heinze K,Wever R,Schroder H C,Muller W E G,Tremel W.Adv Funct Mater,2011,21:501.

[15] He W W,Liu Y,Yuan J S,Yin J J,Wu X C,Hu X N,Zhang K,Liu J B,Chen C Y,Ji Y L,Guo Y T.Biomaterials,2011,32:1139.

[16] Chen W,Chen J,Liu A L,Wang L M,Li G W,Lin X H.Chemcatchem,2011,3:1151.

[17] Hong L,Liu A L,Li G W,Chen W,Lin X H.Biosens Bioelectron,2013,43:1.

[18] Mu J S,Wang Y,Zhao M,Zhang L.Chem Commun,2012,48:2540.

[19] Zhang L N,Deng H H,Lin F L,Xu X W,Weng S H,Liu A L,Lin X H,Xia X H,Chen W.Anal Chem,2014,86:2711.

[20] Shi W B,Wang Q L,Long Y J,Cheng Z L,Chen S H,Zheng H Z,Huang Y M.Chem Commun,2011,47:6695.

[21] Cheng H L,Wei L T.Analytica Chimica Acta,2011,703:87.

[22] Bai Y H,Du Y,Xu J J,Chen H Y.Electrochemistry Communications,2007,9:2611.

[23] Dontsova E A,Zeifman Y S,Budashov I A,et al.Sensors and Actuators B,2011,159:261.

[24] Li Y,Wei J X,Chen S M.Int J Electrochem Sci,2011,6:3385.

[25] Zhang Z X,Wang X L,Yang X R.Analyst,2011,136:4960.

[26] Wang C I,Chen W T,Chang H T.Analytical Chemistry,2012,84:9706.

[27] Qian J,Yang X,Jiang L,Zhu C,Mao H,Wang K.Sensor Actuat B -Chem,2014,201:160.

[28] Meegle S M,Ananya B,Pradeep T,Kuruvilla J.Biosensors and Bioelectronics,2016,81:68.

[29] Li H C,Guo Y X,Xiao L H,Chen B.Biosens Bioelectron,2014,59:289.

[30] He S B,Deng H H,Liu A L,Li G W,Lin X H,Chen W,Xia X H.Chem Cat Chem,2014,6(6):1543.

[31] He S B,Wu G W,Deng H H,Liu A L,Lin X H,Xia X H,Chen W.Biosensors and Bioelectronics,2014,62:331.

[32] Zhang Y D,Cai Y N,Qi Z L,Lu L,Qian Y X.Anal Chem,2013,85(17):8455.

[33] Chen Z Z,Ren X L,Meng X W,Tan L F,Chen D,Tang F Q.Elsevier,2013,44:204.

[34] Liang M,Fan K L,Pan Y,Jiang H,Wang F,Yang D L,Lu D,Feng J,Zhao J J,Yang L,Yan X Y.Analytical Chemistry,2013,85:308.

[35] Liu Y J,Wang G C,Li C P,et al.Materials Science and Engineering C,2014,35:253.

[36] Sanjay U,Golime R R,Mukesh K S,Bijoy K B,Vepa K R,Vijayaraghavan R.Biosensors and Bioelectronics,2009,25:832.

[37] Li H C,Guo Y X,Xiao L H,Chen B.Analyst,2014,139:285.