不同熱劑量等級(jí)的微波消融治療對(duì)結(jié)腸癌小鼠T細(xì)胞的影響

尚夢(mèng)園，于峰，趙雙雙，吳新財(cái)，杜睿，陳寶定

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，占胃腸道腫瘤的第3位［1］。近年來，結(jié)腸癌的發(fā)病率與病死率在我國呈上升趨勢(shì)，達(dá)到甚至超過了西方發(fā)達(dá)國家的平均水平，其發(fā)病年齡在40歲以上，高發(fā)年齡普遍在50～60歲，比西方國家平均提早 10歲［2－3］。結(jié)腸癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的概率高達(dá)50%。研究認(rèn)為，結(jié)腸癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的概率與結(jié)腸靜脈血通過門靜脈進(jìn)入肝臟有密切關(guān)系。流行病學(xué)調(diào)查顯示，隨著年齡的增大，結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生率越高，可能與年齡增大者機(jī)體免疫力下降有關(guān)［4］。

超聲引導(dǎo)下的熱消融治療具有操作簡(jiǎn)單、安全、療效好的優(yōu)點(diǎn)，近年來已經(jīng)成功應(yīng)用于各類腫瘤的微創(chuàng)介入治療［5－7］。微波消融屬于熱消融的一種。已有研究證實(shí)，微波消融治療不僅能直接使腫瘤細(xì)胞凝固壞死，滅活腫瘤組織，而且還能提高患者免疫細(xì)胞數(shù)量及其抗腫瘤能力。但何種劑量等級(jí)既能有效殺傷腫瘤細(xì)胞又能最大限度地激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫尚無研究，本實(shí)驗(yàn)比較不同熱劑量等級(jí)的微波消融治療對(duì)結(jié)腸癌小鼠T細(xì)胞的影響。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

1.1.1動(dòng)物與瘤株 C57BL／6小鼠，6～8周齡，體重（20±2）g，購自江蘇大學(xué)動(dòng)物中心；MC38結(jié)腸癌細(xì)胞株由江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究所提供。

1.1.2試劑及設(shè)備 FITC標(biāo)記的抗小鼠CD3抗體、PECy5標(biāo)記的抗小鼠CD4抗體、PE標(biāo)記的抗小鼠CD8抗體，相應(yīng)同型對(duì)照均為Biolend公司產(chǎn)品；KY-2000微波消融治療儀購于南京億高微波電子研究所，微波頻率為2 450 MHz，輸出功率范圍為5～20W且連續(xù)可調(diào)，微波電極針直徑為1.2 mm；流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.2　方法

1.2.1結(jié)腸癌荷瘤小鼠模型的建立 將在體外培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MC38細(xì)胞消化后制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×107／mL，用1 mL胰島素注射器在C57BL／6小鼠的右前肢皮下接種0.1 mL，建立小鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤模型。當(dāng)小鼠荷瘤9 d，腫瘤體積長(zhǎng)至約1 000 mm3時(shí)，認(rèn)為模型制作成功。

1.2.2分組 腫瘤細(xì)胞接種9 d后，選取40只腫瘤體積約1 000 mm3的小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。對(duì)照組不作任何處理，微波消融治療分為低劑量組（5W、60 s），中劑量組（10W、60 s）和高劑量組（15 W、60 s）。

1.2.3微波消融荷瘤小鼠腫瘤 小鼠腹腔注射水合氯醛0.1 mL麻醉后，固定于自制小鼠手術(shù)臺(tái)。常規(guī)消毒、鋪巾，切開皮膚，沿腫瘤長(zhǎng)徑方向插入微波天線，接通微波消融治療儀，對(duì)小鼠進(jìn)行不同熱劑量等級(jí)的微波消融治療，根據(jù)不同分組調(diào)整能量輸出，持續(xù)60 s（圖1）。消融后皮下腫瘤原位留置，待小鼠從麻醉中蘇醒后，送回動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

圖1　高劑量組小鼠微波消融超聲圖

1.2.4觀察小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況 于微波消融后的7 d、14 d時(shí)，經(jīng)超聲測(cè)量各組小鼠瘤體的體積。

1.2.5檢測(cè)小鼠脾臟T細(xì)胞變化 微波消融后14 d，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟中的 CD3＋T、CD4＋T、CD8＋T細(xì)胞。①標(biāo)本采集：脫頸處死小鼠，切開腹部摘取脾臟，將脾臟放置于4℃預(yù)冷的PBS緩沖液中。②脾淋巴細(xì)胞分離：將脾臟置于篩網(wǎng)上，用5 mL注射器內(nèi)芯研磨脾臟組織，而后用PBS緩沖液沖洗篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液，室溫下500×g離心10 min。棄上清液后加入紅細(xì)胞裂解液2 mL，混合均勻，溫室下放置10 min，500×g離心10 min。棄上清液，加PBS緩沖液2 mL，細(xì)胞混合均勻，調(diào)整細(xì)胞密度為106／mL。③ 流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾臟中T淋巴細(xì)胞。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1　微波消融術(shù)后荷瘤小鼠腫瘤體積的變化

4組小鼠微波消融后第7天和第14天時(shí)，分別用超聲測(cè)量腫瘤大小，結(jié)果顯示，微波消融處理后小鼠腫瘤體積較對(duì)照組明顯縮?。≒＜0.05）。見表1。

表1　微波消融術(shù)后荷瘤小鼠腫瘤體積n＝10，mm3，±s

表1　微波消融術(shù)后荷瘤小鼠腫瘤體積n＝10，mm3，±s

組別　第7天　第14天對(duì)照組1 390±80.5　1 688±89.3低劑量組　988±40.8　837±72.8中劑量組　970±55.7　803±90.4高劑量組　623±79.2　525±65.7 F值16.342　18.227 P值?。?.05?。?.05

2.2　微波消融術(shù)后荷瘤小鼠T細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

高、中、低劑量組的 CD3＋T、CD4＋T細(xì)胞均高于對(duì)照組（P＜0.05或 ＜0.01），且高劑量組明顯高于中、低劑量組（P＜0.05）。高劑量組的CD4＋／CD8＋T細(xì)胞比值明顯高于中、低劑量組（P＜0.05），且與對(duì)照組相比，增高顯著（P＜0.01）。4組間的CD8＋T細(xì)胞不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見圖2、表2。

圖2　小鼠脾臟淋巴細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

表2　小鼠脾臟中T淋巴細(xì)胞比例

3　討論

本研究結(jié)果顯示，微波消融術(shù)后，腫瘤體積減小；與對(duì)照組相比，各劑量組脾臟細(xì)胞中的CD3＋T、CD4＋T細(xì)胞和CD4＋／CD8＋T比值均增加，其中高劑量組顯著增加。上述結(jié)果提示，微波消融后的小鼠免疫力有所提高。另外，本研究同時(shí)也顯示，中、低劑量組的 CD3＋T、CD4＋T細(xì)胞和 CD4＋／CD8＋T比值并無明顯差別，說明高劑量的微波消融治療更加有利于提高小鼠的免疫力。

結(jié)腸癌好發(fā)于中老年人，可發(fā)生肝、肺轉(zhuǎn)移，是威脅中老年人的重大疾病之一［8］。近年來，隨著控溫技術(shù)的不斷改善，局部熱消融治療已成為繼手術(shù)、放療、化療之后的又一重要治療手段。局部熱消融包括射頻消融和微波消融［9］，相對(duì)于射頻消融，微波消融有多個(gè)微波能量源，組織加熱不受電阻和傳導(dǎo)性的影響，而電磁波可以在更短的時(shí)間內(nèi)使組織溫度達(dá)到更高。近年來，微波消融技術(shù)提高了熱效率，增加了消融體積，使得大腫瘤和富血供臟器腫瘤的治療成為可能，拓展了該技術(shù)在臨床腫瘤治療應(yīng)用的領(lǐng)域［10－11］。

“腫瘤微環(huán)境”理論認(rèn)為腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)能準(zhǔn)確地反映宿主對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)。許多研究都證實(shí)，熱消融不僅能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞起到直接殺傷作用，還可從多個(gè)環(huán)節(jié)激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。Zerbini等［12］報(bào)道，消融產(chǎn)生的高溫能使肝腫瘤組織發(fā)生凝固性壞死，大量壞死組織作為抗原能夠產(chǎn)生持續(xù)性的局部炎癥反應(yīng)，活化抗原遞呈細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，改善機(jī)體抗腫瘤免疫耐受狀態(tài)。抗腫瘤免疫應(yīng)答主要以由細(xì)胞免疫為主［13－14］，其中T淋巴細(xì)胞在腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，CD4＋T細(xì)胞主要介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的耐受，既可識(shí)別腫瘤細(xì)胞分泌的可溶性抗原，又可釋放多種細(xì)胞因子參與抗瘤效應(yīng)，共同發(fā)揮抗瘤作用。而CD8＋T細(xì)胞可以在促炎因子的作用下分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，加強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。CD4＋T和CD8＋T細(xì)胞相互誘導(dǎo)和制約形成T細(xì)胞網(wǎng)，保持一定的比值，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng)和維持免疫平衡有重要意義。CD4＋／CD8＋T比值的下降，表明機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)受到腫瘤的抑制；比值上升，提示免疫功能的恢復(fù)或增強(qiáng)。本研究中，與對(duì)照組相比，微波消融各劑量組 CD3＋T、CD4＋T細(xì)胞和CD4＋／CD8＋T比值均不同程度地增加，測(cè)量所得小鼠腫瘤體積減小，說明小鼠免疫力提高。但四組間的CD8＋T細(xì)胞無顯著性差異，提示小鼠免疫系統(tǒng)的殺傷功能沒有明顯增加。分析原因，可能與各種免疫細(xì)胞活化程度的不同或（和）腫瘤局部浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞存在差異有關(guān)，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示，中、低劑量組 CD3＋T、CD4＋T細(xì)胞，CD4＋／CD8＋T比值無明顯差別，分析原因：①低、中熱劑量雖對(duì)腫瘤細(xì)胞造成了一定程度的損傷，但這種損傷可逆。② 體內(nèi)熱療時(shí)，腫瘤組織內(nèi)熱劑量分布不均，可能導(dǎo)致一部分瘤組織仍存活。因此，低、中熱劑量不足以對(duì)抗腫瘤負(fù)荷。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，微波消融治療不僅是一種單純的物理干預(yù)措施，更可以提高機(jī)體的免疫功能，改善免疫狀態(tài)，控制腫瘤復(fù)發(fā)。且高劑量的微波消融治療能更好地發(fā)揮抗腫瘤作用。

［參考文獻(xiàn)］

［1］孫敬國，蔣曉忠.Twist蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系研究［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2011，4（14）：1311－1314.

［2］鄭靈巧，馬彥明.大腸癌發(fā)病率不斷攀升［J］.老年健康，2011（5）：4.

［3］Simoglou C，Gymnopoulou I，Babalis D，et al.Surgery of colon cancer in a district hospital［J］.Hell J of Surg，2012，84（1）：71－75.

［4］Whiteford MH，Whiteford HM，Yee LF，et al.Usefulness of FDGPET scan in the assessment of suspected metastatic or recurrent adenocarcinoma of the colon and rectum［J］.Dis Colon Rectum，2000，43（6）：759－767.

［5］YueWW，Wang SR，Lu F，et al.Radiofrequency ablation vs.microwave ablation for patientswith benign thyroid nodules：a propensity scorematching study［J］.Endocrine，2017，55（2）：485－495.

［6］Korkusuz H，Happel C，Koch DA，et al.Combination of ultrasound-guided percutaneous microwave ablation and radioiodine therapy in benign thyroid disease：a 3-month follow-up study［J］.Rofo，2016，188（1）：60－68.

［7］Cornman-Homonoff J，Miller ZA，Smirniotopoulos J，et al.Preoperative percutaneousmicrowave ablation of long bonemetastases using a parallelmedullary approach for reduction of operative blood loss［J］.JVasc Interv Radiol，2017，28（7）：1069－1071.

［8］Huang H，Hao S，Li F，et al.CD4＋Th1 cell promote CD8＋T cell survival，memory response，tumor localization and therapy by targeted delivery of interleukin 2 via acquired pMHCI complexes［J］.Immunology，2007，120（2）：148－159.

［9］Oizumi S，Strbo N，Pahwa S，et al.Molecular and cellular requirement for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes［J］.J Immunol，2007，179（4）：2310－2317.

［10］Lardiere-Deguelte S，De Mestier L，Amroun KL，et al.Laparoscopic thermal ablation of splenic metastases initial experience and present aspects［J］.J Visc Surg，2013，50（5）：355－358.

［11］Liu QD，Song Y，Zhou NX，et al.Radiofrequency ablation of splenic tumors：a case series［J］.JGastrointestin Liver Dis，2013，22（1）：105－108.

［12］Zerbini A，Pilli M，Penna A，et al.Radiofrequency thermal ablation of hepatocellular carcinoma liver nodules can activate and enhance tumor-specific T-cell responses［J］.Cancer Res，2006，66（2）：1139－1146.

［13］Pashenkov M，Go?ss G，Wagner C，etal.PhaseⅡ trial of a toll-like receptor 9-activating oligonucleotide in patientswithmetastaticmelanoma［J］.JClin Oncol，2006，24（36）：5716－5724.

［14］Lonsdorf AS，Kuekrek H，Stern BV，et al.Intratumor CpG-oligodeoxynucleotide injection induces protective antitumor T cell immunity［J］.J Immunol，2003，171（8）：3941－3946.