銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用逆轉(zhuǎn)A549／DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性

董燕，李月英，張心馳，楊小明，厲琳杰，馬文斌

（江蘇大學(xué)1.醫(yī)學(xué)院，2.食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013）

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌80%～85%［1］。目前，基于鉑類藥物的聯(lián)合化療方案是NSCLC標(biāo)準(zhǔn)的藥物治療方案之一，但其毒副作用大且易產(chǎn)生耐藥性，是治療失敗的重要原因［2］。研究表明，中藥因其毒副作用小，效價(jià)高，在臨床腫瘤輔助治療中發(fā)揮重要作用［3］。

核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2 related factor 2，Nrf2）是一種抗氧化應(yīng)激的核轉(zhuǎn)錄因子［4］，其激活后自Keap1蛋白解離進(jìn)入胞核與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因多藥耐藥相關(guān)蛋白1（multidrug resistance associated protein 1，Mrp1）等表達(dá)，參與細(xì)胞耐藥性的調(diào)控［5－6］。Nrf2-ARE信號(hào)通路在癌癥中呈高表達(dá)，促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展，是誘發(fā)多種癌細(xì)胞耐藥產(chǎn)生的重要因素［7］。在肺癌和乳腺癌中，下調(diào)Nrf2可顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性［8］。因此，亟待尋找一種抑制Nrf2／Keap1信號(hào)通路的新型物質(zhì)，來輔助治療化療耐藥的肺癌。

銀杏作為中國傳統(tǒng)藥物，已有上千年的治療歷史［9］。銀杏酚C17 1是銀杏外種皮提取物烷基酚類化合物中的銀杏酚單體之一，具有細(xì)胞毒性，但低劑量時(shí)細(xì)胞毒性較弱［10］。有研究揭示，與銀杏酚其他單體比較，銀杏酚C17 1抗腫瘤活性最高，可抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［11］。本課題組前期研究結(jié)果表明［12］，銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，但其能否作為順鉑的輔助藥物增強(qiáng)化療敏感性尚不清楚。因此，本研究將銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)合作用，觀察A549／DDP耐藥細(xì)胞中Nrf2／Keap1信號(hào)通路及下游蛋白Mrp1表達(dá)的情況，探討銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用對A549／DDP耐藥細(xì)胞的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　材料

人肺腺癌A549、A549／DDP細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。純度98%銀杏酚C17 1（江蘇大學(xué)食品學(xué)院）；RPMI 1640（Wisent公司）；胎牛血清（Gibco公司）；順鉑、MTT試劑（Sigma公司）；Transwell小室（Corning公司）；流式細(xì)胞凋亡檢測試劑盒Annexin V-FITC／PI（美國BD公司）；二甲基亞砜（Sigma公司）；Mrp1、Keap1、Bcl2、Bax、β-肌動(dòng)蛋白及組蛋白H3抗體（Cell Signaling Technology公司）；Nrf2蛋白抗體（Abcam公司）；HRP標(biāo)記的兔二抗、鼠二抗（碧云天生物技術(shù)公司）；PVDF膜、ECL-plus發(fā)光劑（美國Millipore公司）。

1.2　方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) A549、A549／DDP細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育；在A549／DDP細(xì)胞培養(yǎng)基中加入1 mg／mL順鉑維持 A549／DDP細(xì)胞的耐藥性。細(xì)胞生長密度達(dá)90%時(shí)用胰酶消化傳代；取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT法檢測細(xì)胞活性 收集 A549、A549／DDP細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成1×105／mL，接種于96孔板，每孔100μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行分組，在檢測順鉑對細(xì)胞活性的影響時(shí)，分為對照組（順鉑0 mg／L）和實(shí)驗(yàn)組（順鉑 1，2，4，8，16 mg／L），分別作用于A549／DDP細(xì)胞24 h；在檢測銀杏酚與順鉑聯(lián)用對耐藥細(xì)胞活性的影響時(shí)，分為對照組［順鉑（0 mg／L）＋銀杏酚（0 mg／L）］和實(shí)驗(yàn)組［不同濃度順鉑（1、2、4、8、16 mg／L）分別與不同濃度銀杏酚 C17 1（10、20、40mg／L）］，共同作用于A549／DDP細(xì)胞24 h；每孔加入10μLMTT溶液（5mg／mL），避光培養(yǎng)4 h；棄培養(yǎng)液，每孔加入100μL二甲基亞砜，徹底混合。使用酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）在490 nm波長處測量光密度值（D）。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞相對存活率＝（實(shí)驗(yàn)組D均值－空白對照組D均值）／（實(shí)驗(yàn)對照組D均值－空白對照組D均值）。

1.2.3Transwell實(shí)驗(yàn)檢測 A549／DDP細(xì)胞遷移和侵襲能力

1.2.3.1細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期 A549／DDP細(xì)胞，胰酶消化，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105／mL。用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基配置藥物，在下室（24孔板底部）加入500μL含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，上室加入300μL懸浮細(xì)胞以及相應(yīng)的藥物（0 mg／mL順鉑，4 mg／mL順鉑，4 mg／mL順鉑分別與 10、20、40 mg／L銀杏酚 C17 1聯(lián)用），于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；4%低聚甲醛固定細(xì)胞30 min；吉姆薩染液染色20 min；蒸餾水清洗小室，用棉花將上室內(nèi)的染液輕輕擦干，待晾干后于高倍鏡下（×200）觀察細(xì)胞，隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)（遷移細(xì)胞數(shù)）。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞遷移率＝實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)／對照組遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.3.2細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 用4℃預(yù)冷的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠至終濃度為1 mg／mL；取60μL加入小室上部，37℃溫育4～5 h使其干成膠狀；后續(xù)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.4免疫印跡法檢測Nrf2／Keap1信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 將對數(shù)生長期A549／DDP細(xì)胞接種于6孔板，每孔約1×106個(gè)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)過夜后，分別加入含 0 mg／mL，4 mg／mL順鉑，4 mg／mL順鉑分別與10、20、40 mg／L銀杏酚 C17 1聯(lián)用的培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；加入預(yù)熱的細(xì)胞裂解液（70μL）裂解細(xì)胞，提取總蛋白；100℃煮沸5min；超聲儀破碎10 s，離心30 s；提取的蛋白儲(chǔ)存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

配置10%或12%聚丙烯酰胺凝膠，70 V電泳2 h；轉(zhuǎn)膜（PVDF膜）2 h；用含 5%牛奶的 TBST（80 g／L NaCl，2 g／L KCl，30 g／L Tris，0.1%Tween-20；pH＝7.4）封閉 1 h；加入一抗 Nrf2、Keap1、Mrp1、Bcl2、Bax抗體（1 1 000）及內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白和組蛋白H3抗體（1 1 000）4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min；除內(nèi)參 β-肌動(dòng)蛋白為鼠二抗（1 1 000），其他蛋白均為兔二抗（1 1 000），孵育1 h；TBST洗膜3次，每次15min；ECL發(fā)光劑曝光；Lane 1D凝膠分析軟件進(jìn)行灰度掃描，得出灰度值。蛋白相對表達(dá)量＝目的蛋白灰度值／β-肌動(dòng)蛋白灰度值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)期生長A549／DDP細(xì)胞，均勻接種于24孔板，每孔約3×104個(gè)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。過夜貼壁后加藥（0 mg／mL順鉑，4 mg／mL順鉑，4mg／mL順鉑分別與 10、20、40 mg／L銀杏酚 C17 1聯(lián)用）培養(yǎng) 24 h；用0.25%無EDTA的胰酶消化細(xì)胞，蒸餾水洗3次，離心；取100μL過篩后的細(xì)胞（3×104個(gè)／mL）懸浮于流式管中，于冰上避光條件下依次加入10μL Annexin V-FITC和5μL PI，輕輕混勻；10 min后加入緩沖液400μL，設(shè)置一組單染的陽性對照，2 h內(nèi)利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s）表示，多組比較行單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Origin法計(jì)算肺腺癌細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度（50%inhibitory concentration，IC50）。

2　結(jié)果

2.1　順鉑對敏感A549細(xì)胞和耐藥細(xì)胞A549／DDP細(xì)胞活性的影響

MTT檢測結(jié)果如圖1所示，單獨(dú)順鉑作用，敏感A549細(xì)胞和耐藥A549／DDP細(xì)胞活性均不同程度地被抑制，但抑制A549／DDP細(xì)胞活性明顯需要更高濃度的順鉑；經(jīng)計(jì)算得出 A549和 A549／DDP細(xì)胞的 IC50所需的順鉑濃度分別為（7.0±0.09）mg／L和（40.0±0.13）mg／L，A549／DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性是A549細(xì)胞的5.8倍，表明A549／DDP是順鉑耐藥細(xì)胞株。根據(jù)MTT的結(jié)果，本研究選取4 mg／L順鉑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1　不同濃度的順鉑對A549和A549／DDP細(xì)胞活性的影響

2.2　銀杏酚C17 1對A549／DDP耐藥細(xì)胞遷移的影響

與對照組比較，順鉑組耐藥細(xì)胞遷移率沒有顯著的變化（P＞0.05）；但與對照組及順鉑組相比，10，20，40 mg／L銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用明顯抑制耐藥細(xì)胞的遷移能力（P＜0.05），且呈銀杏酚C17 1劑量依賴性。見圖2。結(jié)果表明，銀杏酚C17 1能增強(qiáng)順鉑對A549／DDP耐藥細(xì)胞遷移的抑制能力。

2.3　銀杏酚C17 1對A549／DDP耐藥細(xì)胞侵襲的影響

如圖3所示，與對照組相比，順鉑組細(xì)胞侵襲力稍有降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對照組及順鉑組比較，銀杏酚與順鉑聯(lián)用時(shí)，隨著銀杏酚C17 1濃度（10，20，40 mg／L）的升高，細(xì)胞侵襲數(shù)量呈明顯下降趨勢（P＜0.05）。由此說明，銀杏酚C17 1能夠增強(qiáng)順鉑對A549／DDP耐藥細(xì)胞侵襲的抑制能力。

2.4　銀杏酚C17 1對A549／DDP細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

MTT法檢測結(jié)果如圖4所示，與對照組相比，銀杏酚 C17 1（10，20，40mg／L）與順鉑1mg／L聯(lián)用時(shí)，細(xì)胞存活率沒有明顯變化（P＞0.05）；同時(shí)，銀杏酚 C17 1（10，20 mg／L）與順鉑 2 mg／L聯(lián)合作用時(shí)，細(xì)胞活性較對照組也沒有明顯差異（P＞0.05）。其余各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性與對照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或 P＜0.01）。結(jié)果表明，銀杏酚C17 1劑量上調(diào)增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性，逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞對順鉑的耐藥性。

圖2　不同劑量銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用對A549／DDP耐藥細(xì)胞遷移的影響（×200）

2.5　銀杏酚C17 1對A549／DDP耐藥細(xì)胞Nrf2／Keap1信號(hào)通路的影響

如圖5所示，與對照組和順鉑組相比，順鉑與不同濃度銀杏酚 C17 1（10，20，40 mg／L）聯(lián)合應(yīng)用組總Nrf2與核內(nèi)Nrf2表達(dá)明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），其結(jié)合蛋白 Keap1表達(dá)明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）。

圖3　不同劑量銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用對A549／DDP耐藥細(xì)胞侵襲的影響（×200）

圖4　不同劑量銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用對A549／DDP耐藥細(xì)胞活性的影響

圖5　不同劑量銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用對A549／DDP耐藥細(xì)胞Nrf2／Keap1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

同時(shí)下游Mrp1蛋白表達(dá)也明顯降低（P＜0.05）。由此表明，銀杏酚 C17 1可能通過抑制Nrf2／Keap1信號(hào)通路逆轉(zhuǎn) A549／DDP細(xì)胞的耐藥性。

2.6　銀杏酚C17 1對A549／DDP耐藥細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與對照組及順鉑組相比，隨著銀杏酚C17 1濃度的增加，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)逐漸增強(qiáng)（P＜0.05），而抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)逐漸被抑制（P＜0.05）。Bcl2／Bax比值呈現(xiàn)明顯下降趨勢（P＜0.05），故可初步推斷銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用能夠促進(jìn)耐藥細(xì)胞A549／DDP的凋亡。

圖6　不同劑量銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用對A549／DDP耐藥細(xì)胞凋亡蛋白的影響

2.7　銀杏酚C17 1對A549／DDP耐藥細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，對照組自發(fā)凋亡率與順鉑組比較無明顯差異（P＞0.05），而銀杏酚C17 1（10，20，40 mg／L）與順鉑聯(lián)用后，與對照組及順鉑組相比，早期凋亡率顯著升高（P＜0.05），且呈銀杏酚濃度依賴性。見圖7。由此進(jìn)一步確定銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用能促進(jìn)A549／DDP細(xì)胞凋亡。

3　討論

肺癌的病死率逐年增加，大多數(shù)患者的死亡受到不同程度耐藥的影響［13］。近來研究發(fā)現(xiàn)，基于中藥成分的抗癌藥物具有良好的安全性、穩(wěn)定性和效價(jià)高等特點(diǎn)，如銀杏提取物（Ginkgo biloba）［14］。遷移和侵襲能力是腫瘤惡性的生物學(xué)標(biāo)志［15］。本研究Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用，抑制肺癌耐藥細(xì)胞的遷移和侵襲能力且呈濃度依賴性；此外，銀杏酚C17 1作用后，順鉑對A549／DDP細(xì)胞的IC50顯著下降，提高了耐藥細(xì)胞對順鉑的敏感性。上述結(jié)果初步確定銀杏酚C17 1可增強(qiáng)肺癌耐藥細(xì)胞對順鉑的敏感性。

圖7　不同劑量銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用對A549／DDP耐藥細(xì)胞凋亡的影響

多藥耐藥的產(chǎn)生機(jī)制繁雜，其中Mrp1和肺耐藥蛋白（Lrp）表達(dá)改變是耐藥的重要機(jī)制之一［16］。Nrf2／Keap1信號(hào)通路參與非小細(xì)胞肺癌Mrp1的表達(dá)調(diào)控，當(dāng)Keap1表達(dá)下降或被其他蛋白如P62競爭結(jié)合后，致Nrf2入核與ARE元件上的Mrp1基因啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)耐藥蛋白Mrp1的表達(dá)［6］。Keap1為Nrf2的負(fù)調(diào)控蛋白，在一些腫瘤如肺癌細(xì)胞中，Keap1的突變致Nrf2活性增強(qiáng)，并與標(biāo)準(zhǔn)化療耐藥及肺癌患者高死亡率相關(guān)［17］。本研究顯示，與對照組相比，單獨(dú)順鉑組肺癌耐藥細(xì)胞株中總Nrf2沒有呈高表達(dá)，但核Nrf2高表達(dá)，說明細(xì)胞內(nèi)Nrf2的分布發(fā)生了變化。胞質(zhì)Nrf2入核后，促進(jìn)下游耐藥蛋白Mrp1的高表達(dá)，進(jìn)而抑制藥物進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性作用；Keap1作為Nrf2抑制劑，其低表達(dá)不僅減少Nrf2的降解，同時(shí)增強(qiáng)Nrf2入核進(jìn)而激活Nrf2。但銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)合作用后，與順鉑組相比，細(xì)胞內(nèi)Keap1高表達(dá)抑制Nrf2入核，進(jìn)而核內(nèi)Nrf2減少，抑制下游耐藥蛋白Mrp1的表達(dá)，減弱其發(fā)揮藥物外排的作用。由此表明，銀杏酚C17 1可能通過抑制Nrf2／Keap1信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對順鉑的耐藥性。

凋亡是耐藥性細(xì)胞死亡的重要機(jī)制之一，與腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)的調(diào)控基因有Bcl2、Caspase和P53等家族。Bcl2家族成員Bcl2、Bax、單BH3結(jié)構(gòu)域蛋白等組成一個(gè)蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)，通過線粒體外膜的滲透來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡［18］。Bcl2是抗凋亡基因，而Bax是促凋亡基因，Bcl2／Bax比值是細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵，比值升高抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，反之降低則促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［19］。本研究結(jié)果表明，銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用可促進(jìn)肺癌耐藥細(xì)胞的凋亡，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)銀杏酚C17 1增強(qiáng)肺癌耐藥細(xì)胞對順鉑的敏感性，并使凋亡增加。

總之，本研究結(jié)果表明順鉑與銀杏酚C17 1體外同時(shí)作用能對A549／DDP耐藥細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、耐藥蛋白及抗凋亡蛋白產(chǎn)生明顯的抑制效果，輔助增敏作用顯著。

［參考文獻(xiàn)］

［1］Zhang Y，Wang X，Han L，et al.Green tea polyphenol EGCG reverse cisplatin resistance of A549／DDP cell line through candidate genes demethylation［J］.Biomed Pharmacother，2015，69：285－290.

［2］Wu T，Wang MC，Jing L，et al.Autophagy facilitates lung adenocarcinoma resistance to cisplatin treatment by activation of AMPK／mTOR signaling pathway［J］.Drug Des Devel Ther，2015，9：6421－6431.

［3］趙瑛.中藥抗腫瘤藥理作用研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，21（33）：3752－3753.

［4］Suzuki T，Motohashi H，Yamamoto M.Toward clinical application of the Keap1-Nrf2 pathway［J］.Trends Pharmacol Sci，2013，34（6）：340－346.

［5］Xia C，Bai X，Hou X，etal.Cryptotanshinone reverses cisplatin resistance of human lung carcinoma A549 cells through down-regulating Nrf2 pathway［J］.Cell Physiol Biochem，2015，37（2）：816－824.

［6］Ji L，LiH，Gao P，etal.Nrf2 pathway regulatesmultidrug-resistance-associated protein 1 in small cell lung cancer［J］.PLoSOne，2013，8（5）：e63404.

［7］Taguchi K，Yamamoto M.The KEAP1-NRF2 system in cancer［J］.Front Oncol，2017，7：85.

［8］Hayes JD，McMahon M.NRF2 and KEAP1 mutations：permanent activation of an adaptive response in cancer［J］.Trends Biochem Sci，2009，34（4）：176－188.

［9］Kennedy DO，Wightman EL.Herbal extracts and phytochemicals：plant secondarymetabolites and the enhancement of human brain function［J］.Adv Nutr，2011，2（1）：32－50.

［10］王云飛，楊小明，李月英，等.銀杏酚對 SMMC-7721肝癌細(xì)胞和荷H22肝癌小鼠的抗癌作用［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2013，23（3）：233－237.

［11］Li Y，Liu J，Liu Y，et al.Inhibitory effect of Ginkgol C17 1 on the biological behavior of tumor cells［J］.Oncol Lett，2017，13（3）：1873－1879.

［12］Liu J，Li Y，Yang X，et al.Effects of ginkgol C17 1 on cisplatin induced autophagy and apoptosis in HepG2 cells［J］.Oncol Lett，2018，15（1）：1021－1029.

［13］Troncome M，Cargnelli SM，Villani LA，et al.Targetingmetabolism and AMP-activated kinasewithmetformin to sensitize non-small cell lung cancer（NSCLC）to cytotoxic therapy：translational biology and rationale for current clinical trials［J］.Oncotarget，2017，8（34）：57733－57754.

［14］Mei N，Guo X，Ren Z，et al.Review of Ginkgo bilobainduced toxicity，from experimental studies to human case reports［J］.J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev，2017，35（1）：1－28.

［15］Ramer R，Bublitz K，F(xiàn)reimuth N，et al.Cannabidiol inhibits lung cancer cell invasion and metastasis via intercellular adhesion molecule-1［J］.FASEB J，2012，26（4）：1535－1548.

［16］Swerts K，De Moerloose B，Dhooge C，etal.Prognostic significance of multidrug resistance-related proteins in childhood acute lymphoblastic leukaemia［J］.Eur J Cancer，2006，42（3）：295－309.

［17］Yamadori T，IshiiY，Homma S，etal.Molecularmechanisms for the regulation of Nrf2-mediated cell proliferation in non-small-cell lung cancers［J］.Oncogene，2012，31（45）：4768－4777.

［18］Renault TT，Dejean LM，Manon S.A brewing understanding of the regulation of Bax function by Bcl-xL and Bcl-2［J］.Mech Ageing Dev，2017，161（Pt B）：201－210.

［19］Paul I，Jones JM.Apoptosis block as a barrier to effective therapy in non small cell lung cancer［J］.World J Clin Oncol，2014，5（4）：588－594.