血清8b型Ⅰ群禽腺病毒的分離與鑒定

楊 振 董昌海 李 琛 馬玉峰，2 倪 杰 王鉅華 金文杰 錢 鐘*

（1.揚州優(yōu)邦生物藥品有限公司，江蘇揚州 225008；2.金宇生物技術股份有限公司，內蒙古呼和浩特 010030；3.揚州大學 獸醫(yī)學院，江蘇揚州 225009）

禽腺病毒（Fowl adenoviruses）屬于腺病毒科的禽腺病毒屬成員，為無囊膜的雙股DNA病毒[1]。其中Ⅰ群禽腺病毒可以分為12個血清型（FAdV 1-12）。國際病毒分類委員會（ICTV）將禽腺病毒的12個血清型分為5個亞群（FAdV A-E）[2]。Ⅰ群禽腺病毒可以引起包括肉雞[3]、蛋雞[4]、鴨[5]以及鵝[6，7]的多種病變。不同亞群不同血清型的Ⅰ群禽腺病毒有不同的毒力，對家禽有不同的致病能力[2]。例如血清1型（FAdV-1）（FAdV-A）和血清4型（FAdV-4）（FAdV-C）主要引起禽類的肌胃糜爛或潰瘍（GEU）[8，9]和心包積液肝炎綜合征（HHS）。而血清2、7、8a、8b、11型則在世界范圍內引起包涵體肝炎（Inclusion body hepatitis，IBH）癥狀[20]。

包涵體肝炎（Inclusion body hepatitis，IBH）最早于1963美國發(fā)現(xiàn)[10]，1976我國臺灣報道，1988后遼寧、湖南、江蘇、吉林、河南、內蒙古發(fā)生，2007年后又有山東、遼寧、吉林報告發(fā)生此病[11，12]。感染后發(fā)病率不高，7d～20W雞均可發(fā)生，3～7w多發(fā)。主要發(fā)生于雛雞，病雛生長受阻、羽毛蓬亂、蹲伏。多于48h內死亡或逐減康復。雞群發(fā)病后會突現(xiàn)3～5d的死亡高峰。死亡率低，可能至10%，個別可達30%。有時病程也可持續(xù)2～3d。由于目前臨床無批準的禽腺病毒疫苗，禽腺病毒的流行給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失。

本研究從臨床采集發(fā)病雞的肝、脾、肺等病料組織病料中分離到三株病毒。通過實驗室診斷證明所分離的病毒屬于Ⅰ群禽腺病毒（FAdV）成員，與GenBank參考序列進行基因序列對比發(fā)現(xiàn)，分離株為禽腺病毒E基因型血清8b型，分離毒株為禽腺病毒的疫苗研制提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本

2016～2017年從山東省、河南省具有典型病變的肉雞肝、脾、肺等病料組織，其中兩份為山東白羽肉雞，1份為河南海蘭褐蛋雞；

1.2 實驗動物和試劑

SPF雞胚，種蛋購自北京梅里亞維通公司，由本公司研發(fā)中心實驗室孵化；SPF雞由本公司研發(fā)中心實驗室孵化飼養(yǎng)；分別采集健康雞、鴨、鵝、豚鼠、兔子全血（加抗凝劑），參照2015版《中國獸藥典》附錄中“紅細胞懸液制備法”進行配制；Taq酶、RNA酶、dNTP、DNA marker購自南京諾唯贊生物技術有限公司；PCR擴增儀為eppendorf公司產品；擴增禽腺病毒 Hexon基因的特異性通用引物：FAdV-F：5’-AAT GTC CAN ACC GAR AAG GC-3’和FAdV-R：5’- CBG CBT RCA TGT ACT GGT A -3’，目的條帶大小為830bp。0.22μm濾器購自美國Millipore。

1.3 病毒的分離及培養(yǎng)

病毒分離和傳代 取病死雞肝、脾組織，剪碎，按1：5加入滅菌PBS溶液，研磨，勻漿，-70℃反復凍融3次，12000 r/min離心10min，取上清液用0.22μm濾膜過濾，經絨毛尿囊膜接種7日齡SPF雞胚，0.2 ml/枚，每組5枚，同時設對照組雞胚2枚，置37℃孵育。棄去24h內死亡的雞胚，將24h以后死亡的雞胚置4℃冰箱，收集尿囊液進行血凝試驗，同時收取胚體和絨尿膜，無菌研磨后分裝，-70℃冷凍保存?zhèn)溆?。將收獲的尿囊液和絨尿膜以及胚體研磨液100倍稀釋后，經絨毛尿囊膜接種7日齡SPF雞胚進行傳代。

1.4 病毒動物回歸試驗

取40只21日齡健康 SPF雞，分開飼養(yǎng)。實驗組三組分別頸部皮下注射100倍稀釋的病毒液0.2ml，對照組每只注射同等劑量的無菌生理鹽水。每天觀察雞狀況。死亡雞剖檢，取肝、脾組織進行病毒鑒定。

1.5 病毒紅細胞凝集實驗

分別取上述不同來源分離株，濃縮2倍制備成待檢病毒液。按照現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄中的“紅細胞凝集實驗法”，分別對雞、鴨、鵝、豚鼠、兔子的1%紅細胞懸液進行凝集實驗。

1.6 病毒目的基因測定及分析

按照參考文獻[2]所述的方法提取各分離株的基因組。以基因組DNA為模板，禽腺病毒 Hexon基因的特異性引物進行擴增。反應條件如下：95℃預變性5min；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；最后進行72℃延伸10min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠（1.0g/L）電泳進行鑒定，陽性的樣品目的序列克隆后送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，每份樣本進行三次測序，并對測定的序列結果進行BLAST（網址：http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索分析。

2 結果

2.1 病毒分離和培養(yǎng)

三份病料分別接種SPF雞胚后，實驗組雞胚在120～240h內死亡，未接種的對照雞胚均健康存活。與對照雞胚相比，感染胚可見絨毛尿囊膜水腫增厚，胚體全身嚴重出血，多數(shù)胚胎的肝發(fā)黃，有的有出血點（圖1）。每組病死雞胚尿囊液清澈，分別收獲后取樣菌檢，均無細菌和霉菌生長。病毒在SPF雞胚傳代，每代均能致雞胚死亡。

2.2 動物回歸實驗

分離株病毒分別接種21日齡SPF雞后，在72h后開始發(fā)病，發(fā)病時相繼出現(xiàn)精神沉郁，翅膀下垂，羽毛蓬亂，屈腿蹲立（圖2），病死雞剖檢可見腫大，邊緣鈍厚，表面有大小不等出血點、條、斑，黃白色點狀、斑狀壞死灶，色澤偏黃，也可見少量心包積液。與臨床發(fā)病雞癥狀一致。實驗組死亡率為30%～70%，對照組正常，PCR檢測實驗組雞，禽腺病毒陽性率100%。

圖1 病料接種SPF雞胚胚體病變照

圖2 SPF雞攻毒實驗病變圖

2.3 紅細胞凝集實驗

分離的病毒株對雞、鴨、鵝、豚鼠、兔子的1%紅細胞懸液均無血凝性。

2.4 序列測定及分析

2.5 禽腺病毒目的基因擴增及鑒定

各分離株Hexon基因擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，均可見約830bp的目的條帶，DNA大小與預期的結果相符（圖3）。將擴增的目的片段送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，對結果分析顯示，分離株Hexon基因序列均與GenBank數(shù)據(jù)庫中的參考株禽腺病毒最為相近，與參考序列FAdV-8b核苷酸同源性為97.1%～99.1%（圖3），分離株之間的核苷酸同源性為99.5%～100%。

圖3 分離株病毒PCR鑒定結果和同源性分析

2.6 目的基因序列分析

將分離株目的基因與參考序列基因使用MEGA.5[13]軟件構建序列進化樹，結果顯示分離的病毒與E基因型禽腺病毒血清8b型參考序列處于同一個分支（圖5），結果表明分離的病毒為禽腺病毒血清8b型。

圖5 各分離株Hexon基因序列與參考基因序列進化樹分析（Neighbor-joining，1000 replicates）

3 結果與討論

本研究通過PCR 擴增、序列分析和動物試驗，分離了3株病毒，最終確診病毒為血清8b型FAdV。使用針對Ⅰ群FAdV 的Hexon基因特異性引物可以對所有Ⅰ群FAdV進行檢測，測序分析后可進行基因型和血清型的區(qū)分[14]。對分離株病毒經基因分析發(fā)現(xiàn)分離株與Ⅰ群FAdV基因E型血清8b型參考毒株同處一個進化樹分支，親緣關系較近，與參考株的同源性為97.1%～99.1，分離株之間的核苷酸同源性為99.5%～100%，表明不同地區(qū)流行的Ⅰ群禽腺病毒為同一個血清型。Ⅰ群FAdV大多在肉雞上發(fā)生于3-5周齡，偶爾會感染10-20周齡左右蛋雞和種雞[15]。本研究中，山東和河南分離株分別分離自商品白羽肉雞和蛋雞，發(fā)病日齡在三周內，表明該病毒可以感染不同品種的雞群。符合該病的流行病學特點。

根據(jù)之前報道[16]，我們通過絨毛尿囊膜（CAM）途徑接種雞胚進行禽腺病毒FAdV-4的分離，第一代即可成功分離，獲得的病毒毒價高，并能在SPF雞胚上穩(wěn)定傳代。本文中我們使用同樣方法進行病毒分離，成功分離到三株病毒。病毒凝集對雞、鴨、鵝、豚鼠、兔子的1%紅細胞懸液均無血凝性，據(jù)報道[17]，Ⅰ群禽腺病毒中僅FAdV-1能凝集大鼠紅細胞和綿羊紅細胞，但目前還沒有證據(jù)表明禽的Ⅰ群腺病毒的其他血清型能凝集動物的紅細胞。值得注意的是，分離株SD16和HN16對7日齡SPF雞胚10d內致死率為70%左右，而分離株SD17對7日齡SPF雞胚10天內致死率達到98%，提示臨床上FAdV-8b野毒株有毒力增強的可能，這需要我們對分離株進一步的研究。

取三株病毒分別皮下接種21日齡SPF雞（100ELD50/0.2ml），實驗組死亡率為30%～70%，對照組正常，PCR檢測所有實驗組雞，禽腺病毒陽性率100%。病雞羽毛蓬亂、蹲伏。解剖可見肝腫大，表面有大小不等出血點、條、斑，黃白色點狀、斑狀壞死灶，色澤變淡。也可見少量心包積液。這與臨床發(fā)病癥狀是一致的。心包積液可能是急性炎癥反應時心包內炎性滲出物轉化為纖維蛋白性滲出液導致，這可能與雞感染后急性發(fā)病死亡有關[18]，有的學者認為還有其他病原的參與[17]。因禽腺病毒在雞群中廣泛存在且同一只雞經常會感染多個血清型的禽腺病毒[19]，心包積液也可能是其他血清型禽腺病毒混合感染的結果。

目前，Ⅰ群禽腺病毒致病機理以及在我國的流行原因并不是很明確，因引起包涵體肝炎的有多個血清型如FAdV-E的血清型FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-D的血清型FAdV-2、FAdV-11[20]，臨床對包涵體肝炎的防控有很大的挑戰(zhàn)性。我國目前主要流行的是FAdV-4C和FAdV-8b，前者可引起心包積液肝炎綜合征，F(xiàn)AdV-11d也有報道[15]。由于臨床目前無批準的疫苗，禽腺病毒給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大威脅。據(jù)國外研究報道，使用疫苗可以有效防控該病，如在6～30周齡使用FAdV-8b疫苗可以有效地防控肉（種）雞包涵體肝炎[21]。由于該病毒可垂直傳播，若種雞產蛋期帶毒，可大大增加商品雞發(fā)病率和死亡率。有報道指出，在肉種雞29周時肌肉注射免疫FAdV-8b疫苗，在免疫2周后產的種蛋孵化出的商品雞死亡率和發(fā)病率明顯降低[22，23]。因此。開發(fā)針對禽腺病毒的疫苗對防控該病具有重要意義。本研究對禽腺病毒的初步研究為疫苗的開發(fā)提供一定的理論基礎。

[1]Ashish Gupta a，Khawaja Ashfaque Ahmed，et al.Immunogenicity and protective efficacy of virus-like particles and recombinant fiber proteins in broiler-breeder vaccination against fowl adenovirus（FAdV）-8b[J].Vaccine，2017，（35）：2716-2722.

[2]Niczyporuk JS.Phylogenetic and geographic analysis of fowl adenovirus field strains isolated from poultry in Poland[J].Archives of virology，2016（161）：33-42.

[3]Kim JN，Byun SH，Kim MJ，et al.Outbreaks of hydropericardium syndrome and molecular characterization of Korean fowl adenoviral isolates[J].Avian diseases，2008，（52）：526-530.

[4]Niczyporuk JS，Samorek-Salamonowicz E.Czekaj.H.Aviadenoviruses[J].Zycie Weterynaryjne，2010，（85）：821-825.

[5]Chen H，Dou Y，Zheng X，et al.Hydropericardium Hepatitis Syndrome Emerged in Cherry Valley Ducks in China[J].Transboundary and emerging diseases，2016，（10）：125.

[6]徐福州，崔治中，劉岳龍，等.鵝源腺病毒基因組DNA物理圖譜的構建[J].中國病毒學報，2000，（15）：288-294.

[7]Glávits R，Zolnai A，Szabó E，Ivanics E，et al.Comparative pathological studies on domestic geese（Anser anser domestica）and Muscovy ducks（Cairina moschata）experimentally infected with parvovirus strains of goose and Muscovy duck origin[J].Acta veterinaria Hungarica，2005，（53）：73-89.

[8]Okuda Y，Ono M，Shibata I，et al.Comparison of the polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism pattern of the fiber gene and pathogenicity of serotype-1 fowl adenovirus isolates from gizzard erosions and from feces of clinically healthy chickens in Japan[J].Journal of veterinary diagnostic investigation：official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians，2006，（18）：162-167.

[9]Okuda Y，Ono M，Shibata I，Sato S.Pathogenicity of serotype 8 fowl adenovirus isolated from gizzard erosions of slaughtered broiler chickens[J].The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science，2004，（66）：1561-1566.

[10]Saifuddin M，Wilk CR .Vertical transmission of aviana denovirusas soeiated with Inclusion body hepatitis [J].New Zealand Veterinary Joumal，1991，（39）：50-52．

[11]馮王龍，王彩英.肉雞包涵體肝炎的診斷及防治[J].中國禽業(yè)導刊，2009，26（22）：43.

[12]智海東，楊志，解生亮，等.雞包涵體肝炎病毒CELOV株的鑒定研究[J].中國獸藥雜志，2009，43（1）：6-9.

[13]Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al.MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J].Molecular biology and evolution，2011，（28）：2731-2739.

[14]Meulemans G，Boschmans M，Berg TP，et al.Polymerase chain reaction combined with restriction enzyme analysis for detection and differentiation of fowl adenoviruses[J].Avian pathology：journal of the W.V.P.A，2001，（30）：655-660.

[15]Zhao Jing，Zhong Qi，Zhao Ye，et al.Pathogenicity and complete genome characterization of fowl adenoviruses isolated from chickens associated with inclusion body hepatitis and hydropericardium syndrome in China[J].PLo S One，2015，（10）：e0133073.

[16]楊振，董昌海，李甜甜，等.四株Ⅰ群禽腺病毒的分離與鑒定[J].中國家禽，2017，39（19）：73-76.

[17]Y.M.Saif 主編，蘇敬良，高福，索勛（主譯）.禽病學（第12版）[M].北京：中國農業(yè)出版社，2016：290-300.

[18]梁廣成，高 巍，謝泉，等.一株高致病性血清4型禽腺病毒的分離與鑒定[J].中國家禽，2016，38（19）：25-28.

[19]Adair BM，F(xiàn)itzgerald SD.Group I adewnovirus infections.In：Fadly AM，Glisson JR，McDougald LR，Nolan LK，Swayne DE，editors.Diseases of poultry[M].Iowa：Blackwell Publishing，2008：252-256.

[20]Ashish Gupta，Shelly Popowich，Davor Ojkic，et al.Inactivated and live bivalent fowl adenovirus（FAdV8b + FAdV11）breeder vaccines provide broad-spectrum protection in chicks against inclusion body hepatitis（IBH）[J].Vaccine，2018，36（5）：744-750.

[21]Steer PA，O’Rourke D，et al.Application of highresolution melting curve analysis for typing of fowl adenoviruses in field cases of inclusion body hepatitis[J].Aust Vet J，2011，（89）：184-192.

[22]Dawson GJ，Yates VJ，Chang PW，et al.Egg transmission of avian adenovirus-associated virus and CELO virus during a naturally occurring infection[J].Am J Veterinary Res，1979，（40）：1624-1627.

[23]Dawson GJ，Yates VJ，et al.Egg transmission of avian adenovirusassociated virus and CELO virus during experimental infections[J].Am J Veterinary Res，1981，（42）：1833-1837.