蘄蛇蛇毒的研究進(jìn)展

劉宇翔，劉瑤，馮露雅，郭德志，劉明芳＊

（1.湖南省永州市第一中學(xué)，湖南永州 425100；2.永州市異蛇科技實(shí)業(yè)有限公司，湖南永州 425199）

蘄蛇又名五步蛇，學(xué)名尖吻蝮（Agkistrodonacutus），在我國(guó)分布較廣，是我國(guó)十大劇毒蛇之一，其中又以武夷山山區(qū)和皖南山區(qū)儲(chǔ)量最多，其毒液主要作用于血液系統(tǒng)，引起出血、腫脹與局部組織壞死。蘄蛇為蝰科動(dòng)物五步蛇除去內(nèi)臟的干燥體，味甘咸、性溫；有毒。歸肝經(jīng)。功效為祛風(fēng)，通絡(luò)，止痙。用于風(fēng)濕頑痹，麻木拘攣，中風(fēng)口眼?斜，半身不遂，抽搐痙攣，破傷風(fēng)，麻風(fēng)，疥癬[1]。

蘄蛇蛇毒是從蘄蛇的毒腺中分泌的一種毒液，它是一種生物毒素（Biotoxin）。蛇毒的主要生物學(xué)功能是幫助蛇捕食和消化食物，毒蛇分泌的毒液能快速使獵物死亡。一般蛇毒的新鮮毒液呈粘稠的半透明液體，有特殊的腥味[2]，搖晃時(shí)易起泡沫，呈弱酸性，平均每條蛇咬物一次排出的毒液量222.2 mg，毒液中固形物含量為26.2%，含水量為65%～80%，常溫下易失活，置冰箱中一周會(huì)有部分失去活力[3]。

2 化學(xué)成分

2.1 蘄蛇蛇毒成分

蛇毒化學(xué)成分十分復(fù)雜，不同的成分有著不同的藥理作用。其主要成分是蛋白和多肽，占干重的90%～95%，又因蛇的種類、產(chǎn)地、時(shí)間、蛇齡、雌雄、生存環(huán)境等不同而有明顯的差異。蛇毒遇重金屬離子、乙醇、酚類等物質(zhì)時(shí)，立即產(chǎn)生沉淀；高溫環(huán)境下產(chǎn)生絮狀沉淀；遇氧化劑、還原劑亞硫酸鈉、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等，活性成分易被破壞，易被蛋白水解酶所分解；紫外線照射亦能使蛇毒失活；經(jīng)甲醛處理后會(huì)失去毒性，仍保持抗原性，或變成類毒素[4]。蛇毒中的蛋白類物質(zhì)是蛇毒主要毒性成分，主要包括酶和蛇毒素兩大類。另外，蛇毒內(nèi)除含活性酶類外，還有其他活性多肽。

2.1.1 蘄蛇蛇毒中的酶類成分

目前，蘄蛇中發(fā)現(xiàn)的蛇毒多屬絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和磷脂酶A2家族，部分蛋白質(zhì)可能屬于去整合素家族[5]。蛇毒酶類大多數(shù)屬水解酶類，按其主要毒理作用分三大類：（1）蛋白酶、磷脂酶、精氨酸醋酶、透明質(zhì)酸酶和膠原蛋白酶等，能引起局部毛細(xì)血管和組織損傷與壞死；（2）凝血酶、蛋白酶、磷脂酶A2(PLA2)，能引起各種類型的促凝和抗凝作用；（3）蛇毒中激膚釋放酶可以通過釋放血管舒緩激膚酶，而產(chǎn)生降壓、水腫、疼痛等作用[2]。

有學(xué)者通過平衡透析研究了過氧化氫酶之間與二價(jià)金屬離子的交互性，和金屬離子對(duì)其結(jié)構(gòu)和活性的影響[6]，了解到這種性質(zhì)是所有過氧化氫酶，包括Cu2+離子催化酶中活性必不可少的，而過氧化氫酶是蘄蛇毒液中具有獨(dú)特催化酶活性的酶。酶類中的凝血酶（thrombin-like enzyme）是一種絲氨酸蛋白酶，也是一種磷脂酶A2.PLA2抑制劑，是蘄蛇、眼鏡蛇等毒液內(nèi)具有廣泛抗出血活性酶[7]。降纖酶是安全有效的強(qiáng)力血栓溶解劑，具有蛇毒類凝血酶性質(zhì)，在體外促凝，在體內(nèi)起著消耗纖維蛋白原的作用，會(huì)出現(xiàn)抗凝效果。從蘄蛇蛇毒中分離純化的FIXcaI是一種分子量較小，比較穩(wěn)定，纖溶活性強(qiáng)，可直接降解纖維蛋白，非出血性的新型蛇毒纖溶酶[8]。又從蘄蛇蛇毒的粗毒中分離純化得到多種純組分，如具有凝血酶活力的金屬蛋白，分子量約為28.0 kDa，具有精氨酸酯酶活力和激活因子ⅩⅢ的活性；分子量24.3 kDa的類凝血酶，不具有激活因子ⅩⅢ的活性；分子量約為25.4 kDa的抗凝血因子，不具有磷脂酶A2活性、纖溶活性和出血活性。分離出的新型P-I型金屬蛋白酶，對(duì)溫度敏感，具有抗凝血活性，40℃下抗凝血活性最強(qiáng)，具有出血毒性，無磷脂酶A2活性[9]?？鼓蜃覫（ACF I）是一種C型凝集素從蘄蛇的毒液結(jié)合蛋白，激活因子X(FXa)，可通過鈣離子通道的方式來延長(zhǎng)體外凝血時(shí)間[10]?？鼓蜃覫I(ACF II)則是蘄蛇毒液的凝血因子IX 和凝血因子X結(jié)合的蛋白質(zhì)(IX/X-bp)，是目前為止確定出的第一個(gè)獨(dú)特的雙功能蛋白，其在IX/X-bp家庭抗凝和低血壓患者中有應(yīng)用潛質(zhì)，可通過不同的途徑影響大鼠的血液循環(huán)[11]。同時(shí)蘄蛇的毒液中的ACFII與IX/X-bp具有抗凝和降低血壓活性[12]。

2.1.2 蘄蛇蛇毒中的毒素成分

蛇毒中的毒素種類很多，為非酶的毒素，如膜毒素、細(xì)胞毒素、蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子等。蘄蛇蛇毒內(nèi)含有影響心臟、血管及血液系統(tǒng)的成分，能產(chǎn)生多方面的毒性作用的血循毒素。其臨床表現(xiàn)相當(dāng)于中醫(yī)的火熱毒癥狀，稱為“火毒”。

蛇毒中的神經(jīng)毒素，是蛇毒毒液中最毒的成分，它能使動(dòng)物產(chǎn)生弛緩性麻痹和呼吸衰竭，從而導(dǎo)致動(dòng)物死亡。神經(jīng)毒素是一種由15～18種氨基酸，60～74個(gè)氨基酸鏈所結(jié)合而成的肽鏈，其中最主要的氨基酸是賴氨酸、精氨酸、天門冬氨酸，但亦含有半胱氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸和色氨酸等成分。神經(jīng)毒素的臨床癥狀相當(dāng)于中醫(yī)風(fēng)邪侵襲所致的臨床表現(xiàn)，稱為“風(fēng)毒”。

被蘄蛇咬傷會(huì)產(chǎn)生輕度至中度癥狀與蛋白水解和抗凝血效果，毒液的構(gòu)成的生化和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，毒素仍然未知。

2.2 蘄蛇的化學(xué)成分

張冬璇等[13]綜述了蘄蛇中主要物質(zhì)基礎(chǔ)，包含蛋白質(zhì)和氨基酸類成分、磷脂類成分以及核苷類成分，同時(shí)總結(jié)了前人探究化學(xué)成分的方法和含量測(cè)定。蘄蛇含有3種毒蛋白，AaT-Ⅰ、AaT-Ⅱ、AaT-Ⅲ，同時(shí)含多種蛋白酶，氨基酸類含量高的由天門冬氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、纈氨酸、硫氨酸、酪氨酸和色氨酸等。丁興紅[14]用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定蘄蛇藥材中含尿嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤和尿苷等成分。進(jìn)而可有效的控制蘄蛇藥材品質(zhì)。

3 蘄蛇蛇毒的藥用價(jià)值

3.1 蘄蛇蛇毒的應(yīng)用進(jìn)展

蘄蛇蛇毒的藥用價(jià)值主要體現(xiàn)在釀酒和風(fēng)濕疾病治療中，尤以蘄蛇的蛇酒研究最為突出。其工藝發(fā)展現(xiàn)已成熟生產(chǎn)周期短，原材料利用率高產(chǎn)品質(zhì)量和口感有飛躍進(jìn)步。近些年來，蛇毒的酶類研究也較為廣泛和深入，干蛇毒價(jià)值出口價(jià)每克達(dá)1 465美元，經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高。1976年開始我國(guó)的一些單位也陸續(xù)開展起蘄蛇蛇毒方面的研究如對(duì)蛇毒抗凝組分的分離和醫(yī)用研究。1981年昆明動(dòng)物研究所等單位從蘄蛇毒中獲得去纖蛋白酶，臨床證明抗凝效果明顯，療程短，使用方便。福建醫(yī)科大學(xué)與福建三明制藥廠協(xié)作現(xiàn)已批量生產(chǎn)投放于市場(chǎng)。蛇毒具有廣泛的生物學(xué)活性，現(xiàn)已被應(yīng)用于溶栓、抗癌、止血、止痛等方面，通過研究蛇毒生理作用表明，還可改善微循環(huán)、降壓和神經(jīng)毒性[15]。

3.2 蘄蛇的應(yīng)用進(jìn)展

中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，毒蛇及其毒性成分可通經(jīng)絡(luò)，祛風(fēng)濕，且有強(qiáng)身健體的功效。蛇肉、蛇毒、蛇血、蛇粉、蛇干以及蛇鞭等均可入藥，對(duì)幾十類疾病均有明顯的治療效果，尤以蘄蛇泡酒，對(duì)風(fēng)濕、類風(fēng)濕效果更為顯著，可分為蘄蛇、蘄蛇肉和酒蘄蛇，服用方法分別為研磨吞服、煮散劑，水煎服和酒劑。蘄蛇具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤的藥理作用。藥典中記載蘄蛇飲片炮制方法：蘄蛇去頭、鱗，切成寸段。蘄蛇肉去頭，用黃酒潤(rùn)透后，除去鱗、骨，干燥。酒蘄蛇取凈蘄蛇段，照酒炙法（通則 0213)炒干。每100 kg蘄蛇，用黃酒20 kg。本品為段狀。棕褐色或黑色，略有酒氣[1]。現(xiàn)大量研究表明，蘄蛇具有祛風(fēng)除濕、抗凝抗栓、去除纖維蛋白元、降低血液粘度、擴(kuò)張血管、降低血脂、舒筋活絡(luò)、滋陰補(bǔ)腎等功效，主要治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、坐骨神經(jīng)、本身不遂、四肢麻木、腰酸背痛的癥狀。

王新昌等[16]探索干燥綜合征患者服用益氣養(yǎng)陰?kù)铕龇?蘄蛇的臨床藥效，臨床癥狀好轉(zhuǎn)，疾病活動(dòng)度評(píng)分、生存質(zhì)量評(píng)分、免疫功能均有所改善，尤其是免疫球蛋白G（IgG）大幅度下降。表明蘄蛇水煎劑能減輕干燥綜合征患者病情，改善生活質(zhì)量，可能與其免疫抑制功能有關(guān)。且蘄蛇酶聯(lián)合肝素在治療兔急性下腔靜脈血栓方面是有效的，具有較高的安全性[17]。蘄蛇提取物醇溶性和水溶性部位有一定的抗炎及鎮(zhèn)痛作用，水溶性部位較醇溶性部位的藥效好，可為蘄蛇的臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)作用[18]。

3.3 蛇肽的開發(fā)與利用

Felix等[19]在蛇肽研究中克隆和報(bào)告第一個(gè)5種毒素編碼基因的全長(zhǎng)序列的毒液腺物種：蛇毒金屬蛋白酶（SVMP），蛇毒絲氨酸蛋白酶（SVSP），半胱氨酸分泌蛋白（CRISP），a和b亞基C型外源凝集素蛋白（CLP）和C型利尿鈉肽（NP）。這些基因是高度毒液腺中表達(dá)及其序列表現(xiàn)出一個(gè)公認(rèn)的信號(hào)肽。

國(guó)內(nèi)近年來開始研制并生產(chǎn)的蛇毒抗凝制劑，其主要成分都是蘄蛇蛇毒的分離組分——類凝血酶，類凝血酶具有兩種特性：（1）作用于精氨酸衍生物TAME（a-甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯）的精氨酸酯酶的活性；（2）水解纖維蛋白原大分子物質(zhì)產(chǎn)生凝結(jié)反應(yīng)的活性。該類凝血酶可以迅速、有效地降低纖維蛋白原含量，產(chǎn)生低纖維蛋白原狀態(tài)，還引起纖維蛋白原降解產(chǎn)物升高，說明體內(nèi)有纖維蛋白降解發(fā)生；在誘導(dǎo)組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）升高的同時(shí)還可降低纖溶酶抑制劑（PAI）的活性，使肌體內(nèi)的纖溶活性增強(qiáng)，從而達(dá)到去纖、抗凝、溶解血栓的作用。與此同時(shí)，該酶能降低犬血粘度，還能引起血漿甘油三酯和膽固醇的下降，這一點(diǎn)有利于病理性疾病的恢復(fù)，但其對(duì)血小板含量幾乎無影響，對(duì)血漿其他凝血因子也無明顯影響，所以在抗凝、溶栓的同時(shí)一般不會(huì)引起出血，這是單一組分的類凝血酶應(yīng)用于臨床治療血栓病不同于其他藥品的最大優(yōu)點(diǎn)。

此外，蘄蛇毒素對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎具有抑制作用[20]。有學(xué)者[21]表示重癥急性胰腺炎（SAP）仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)性的疾病，高死亡率，有限的發(fā)病機(jī)制的了解和缺乏特定的治療。重組纖溶酶Ⅱ（r FⅡ）蘄蛇毒液可以降低腫瘤壞死因子-α(TNF-a)和SAP的死亡率。可以減少對(duì)耐受性抗菌藥物的使用。也發(fā)現(xiàn)蘄蛇毒中含有低分子量蛇毒類凝血酶[22]，可避免使蛋白類分子量大成分直接進(jìn)入消化道，易引起人體的過敏反應(yīng)[23]。金銘等[24]采用離子交換和分子篩，以柱層析法分離蛇毒C4組分，并用急性毒性實(shí)驗(yàn)和自然戒斷實(shí)驗(yàn)、耐受性實(shí)驗(yàn)考察其毒性、依賴性和耐受性。得出C4組分在一定劑量范圍內(nèi)是安全的，同時(shí)其鎮(zhèn)痛作用與嗎啡相比，在長(zhǎng)期用藥過程中不產(chǎn)生耐受性和依賴性。楊海波等[25]從桂北蘄蛇毒腺中抽提蛇毒總RNA，采用一步法（RT-PCR和PCR在同一試管內(nèi)進(jìn)行）擴(kuò)增纖溶酶金屬蛋白酶原基因，并進(jìn)行電泳檢測(cè)和基因研究發(fā)現(xiàn)蘄蛇蛇毒中含有血液循環(huán)毒素，其中與血凝失調(diào)有關(guān)的兩種蛋白水解酶，類凝血酶和金屬蛋白酶家族。纖溶酶屬于金屬蛋白酶家族的成員，它作用在人的纖維蛋白酶原或纖維蛋白，使血凝塊溶解。蘄蛇酶還具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放組織型纖溶酶原激活劑（t-PA），使細(xì)胞培養(yǎng)液中t-PA活性升高，t-PA/PAI比值升高，纖維蛋白降解產(chǎn)物明顯增加，提高其纖溶活性的作用[26]。從蘄蛇降纖酶中重組毒液影響并加強(qiáng)超急性排斥反應(yīng)（HAR），HAR是一種主要障礙在異種移植，介導(dǎo)的結(jié)合異種移植的天然抗體和補(bǔ)體的激活劑。目前的治療方法有補(bǔ)體抑制劑和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的發(fā)展器官[27]。

4 展望

李炎等[28]對(duì)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)上檢索和效價(jià)測(cè)定，目前市場(chǎng)上流通的大部分樣品的純度均較低，主要成分為蘄蛇酶，降纖酶注射液的熱穩(wěn)定性較差，質(zhì)量有待提高。蛇毒降纖酶N-linked低聚糖的結(jié)構(gòu)，高度活躍的凝血酶（TLE）純化從蘄蛇的毒液，成功使用MALDI-TOF特征質(zhì)譜結(jié)合順序外切糖苷酶消化。低聚糖的蛇毒液蛋白酶是進(jìn)一步基礎(chǔ)研究的碳水化合物的重要性生物活性[29]。蛇毒作為藥物的開發(fā)力度還不夠，純化不到位。利用蛇毒作為治療癌癥的研究，國(guó)內(nèi)外都已經(jīng)進(jìn)行了長(zhǎng)期的工作，但進(jìn)展仍然不大。臨床上除了蛇毒抗血清藥物，還有一系列注射用制品，國(guó)外學(xué)者研究結(jié)果表明，不肌注的給藥途徑顯著改變蝮蛇毒液的藥物動(dòng)力學(xué)，卻大大降低了毒液的系統(tǒng)生物利用度[30]。所以蛇類生物制品藥理作用和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)還需要進(jìn)行深入的研究，研發(fā)前景廣泛。