環(huán)狀RNA研究進(jìn)展

劉新紅

（重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，重慶 400067）

過(guò)去數(shù)十年間，從真核生物中發(fā)現(xiàn)的具有功能的非編碼RNA種類(lèi)不斷增多。隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物在信息學(xué)的發(fā)展，環(huán)狀RNA（Circular RNA，circRNA）作為非編碼RNA家族重要成員逐漸走進(jìn)人們的視野，其生物學(xué)特性和調(diào)控功能也已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。1976年，Sanger等[1]利用電子顯微鏡在植物感染的類(lèi)病毒（Viroids）及副流感病毒（Sendai virus）顆粒中首次觀察到共價(jià)閉合環(huán)狀RNA分子，這是circRNA的首次發(fā)現(xiàn)和命名。隨后，研究人員相繼在小鼠、猴子、豬、人等物種中發(fā)現(xiàn)了circRNA。然而，由于它們豐度低、特征不常見(jiàn)，這些RNA僅僅被當(dāng)作是異常剪接產(chǎn)物，并沒(méi)有引起廣泛的重視。直到2012年，Salzman J等[2]通過(guò)人類(lèi)小兒急性淋巴細(xì)胞白血病樣品的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)了circRNA在人類(lèi)細(xì)胞的普遍表達(dá)，基于此數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)大約有10萬(wàn)個(gè)circRNA，人們才開(kāi)始重新認(rèn)識(shí)并深入研究這一熱點(diǎn)新星。

1 circRNA的形成機(jī)制

大部分circRNA起源于蛋白質(zhì)編碼基因的外顯子，通常由1～5個(gè)外顯子組成。根據(jù)生物發(fā)生的來(lái)源不同，circRNA可以分為4種類(lèi)型，分別是外顯子circRNA（ExoniccircRNAs，ecRNAs）、內(nèi)含子circRNA（IntroniccircRNAs, ciRNAs）外顯子-內(nèi)含子 circRNA（Exon-intron circRNAs，EIciRNAs）、基因間 circRNA（IntergeniccircRNA）[3]。

關(guān)于circRNA的生物發(fā)生，目前已經(jīng)提出兩種假說(shuō)，分別是“內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化”（直接反向剪接）和“套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化”（外顯子跳讀），當(dāng)前主流觀點(diǎn)認(rèn)為反向剪接機(jī)制在circRNA的生物發(fā)生過(guò)程中起重要的調(diào)控作用[4]。反向剪接機(jī)制過(guò)程是下游外顯子的3＇端反向與上游外顯子5＇端共價(jià)連接形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)過(guò)內(nèi)含子切除過(guò)程形成外顯子circRNA或者不經(jīng)內(nèi)含子切除過(guò)程直接形成外顯子-內(nèi)含子circRNA。外顯子跳讀機(jī)制的過(guò)程是，前體mRNA（pre-RNA）經(jīng)過(guò)經(jīng)典剪接，形成外顯子被跳讀的線性RNA和被跳讀部分形成套索結(jié)構(gòu)，套索結(jié)構(gòu)中內(nèi)含子被切除形成外顯子circRNA或不被切除直接形成外顯子-內(nèi)含子circRNA。以上兩種機(jī)制既有相似之處，也有各自特異的環(huán)節(jié)。直接反向剪接和外顯子跳讀這兩種機(jī)制第一步是不同的：直接反向剪接是由2個(gè)內(nèi)含子互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，從而形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)；而外顯子跳讀則是由外顯子組成的剪接供體（Splice donor）和剪接受體（Splice acceptor）共價(jià)結(jié)合。而在接下來(lái)的步驟中，這兩種機(jī)制的過(guò)程基本一致，即剪接體（Splicesome）切除剩余內(nèi)含子和形成外顯子circRNA或不切除剩余內(nèi)含子形成外顯子-內(nèi)含子circRNA。

研究表明，部分內(nèi)含子在經(jīng)典剪接過(guò)程中也會(huì)形成套索結(jié)構(gòu)，但這一套索結(jié)構(gòu)會(huì)很快在脫支作用下被降解。Zhang等[5]發(fā)現(xiàn)，分支點(diǎn)附近11個(gè)C富集基序和5＇端剪接位點(diǎn)附近7個(gè)GU富集基序這一特殊的核酸序列對(duì)于內(nèi)含子circRNA的生物發(fā)生至關(guān)重要。這一特殊核酸序列可能特異性的參與內(nèi)含子circRNA的生物發(fā)生，因?yàn)樗谕怙@子circRNA和其他類(lèi)型circRNA的生物發(fā)生過(guò)程中并不富集。

2 circRNA的生物學(xué)功能

隨著環(huán)境日益惡化、社會(huì)發(fā)展帶來(lái)的巨大生活壓力，癌癥已成為威脅人類(lèi)健康的第一大殺手。癌癥發(fā)生最重要的一個(gè)原因是細(xì)胞內(nèi)基因組紊亂，基因發(fā)生融合，進(jìn)而產(chǎn)生具有有害功能的融合蛋白。而基因組紊亂的同時(shí)，circRNA也發(fā)生融了，并進(jìn)一步促進(jìn)基因組的紊亂以及有害融合蛋白的產(chǎn)生。深入研究circRNA的生物學(xué)功能，就顯得尤為迫切。

隨著circRNA研究的不斷深入，目前普遍認(rèn)為circRNA在基因表達(dá)調(diào)控方面具有重要作用，如作為miRNA、蛋白的海綿、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子等。最近的發(fā)現(xiàn)還顯示circRNA可以翻譯成一些短肽。

2.1 circRNA作為miRNA的海綿

miRNA是一種約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)的非編碼RNA，通過(guò)特異結(jié)合靶標(biāo)基因非編碼區(qū)，進(jìn)而對(duì)靶標(biāo)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。Salmena L等[6]2011年提出競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA（ceRNA）假說(shuō)，認(rèn)為mRNA、假基因和lncRNA之間通過(guò)miRNA反應(yīng)元件構(gòu)建一個(gè)大規(guī)模的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中l(wèi)ncRNA可以作為miRNA的海綿發(fā)揮作用。與其他ceRNA相比，circRNA具有更好的miRNA親和力，因此circRNA也被稱(chēng)為“超級(jí)海綿”。circRNA作為miRNA海綿最好的一個(gè)例子是ciRS-7，包含74個(gè)能夠與miRNA-7有效結(jié)合的保守位點(diǎn)，ciRS-7與miRNA-7的共存也已經(jīng)被免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明。當(dāng)ciRS-7過(guò)表達(dá)時(shí)，能大量結(jié)合miR-7而導(dǎo)致miR-7靶基因的表達(dá)水平上升；而當(dāng)抑制ciRS-7表達(dá)時(shí)，miR-7靶基因的表達(dá)水平會(huì)降低。相似地，在斑馬魚(yú)胚胎中過(guò)表達(dá)ciRS-7會(huì)導(dǎo)致中腦容量變小，與敲除miR-7后的表型一致，也證明了ciRS-7對(duì)miR-7的海綿作用。

2.2 circRNA作為蛋白的海綿

一些線性非編碼RNA可以與RNA結(jié)合蛋白（RBP）相互作用進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能，故猜測(cè)circRNA的功能也包括與RNA結(jié)合蛋白相互作用。Guo等[7]通過(guò)體內(nèi)交聯(lián)高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)，收集得到20個(gè)RNA結(jié)合蛋白的數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)環(huán)化外顯子的聚集密度略高于其臨近外顯子的密度，暗示circRNA可能與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合。因其自身固有的穩(wěn)定性，circRNA可以作為RNA結(jié)合蛋白的“腳手架（scaffolding）”，聚集多種蛋白并促進(jìn)這些蛋白之間的相互作用。例如circ-Foxo3可以與p21和周期素依賴(lài)激酶CDK2結(jié)合，形成circ-Foxo3-p21-CDK2三原復(fù)合物，影響CDK2的生物學(xué)功能和細(xì)胞周期的進(jìn)展[8]。

2.3 circRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

circRNA可以形成一大組轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，其直接參與基因表達(dá)調(diào)控的作用已經(jīng)在多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)。EIciRNA和ciRNA大量存在于細(xì)胞核內(nèi)且具有很少的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，敲除這些circRNA可以導(dǎo)致其親本基因表達(dá)量顯著降低。例如，circEIF3J或circPAIP2可以與其相應(yīng)的親本基因和U1小核核糖核蛋白顆粒（U1 snRNP）共存，通過(guò)U1 snRNP促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ的聚集進(jìn)而調(diào)控親本基因的表達(dá)[9]。

2.4 circRNA的蛋白翻譯

早期的研究報(bào)道大多數(shù)circRNA不能與核糖體相互作用，導(dǎo)致產(chǎn)生circRNA不太可能翻譯蛋白的觀點(diǎn)。隨著研究的不斷推進(jìn)，研究人員發(fā)現(xiàn)作為circRNA線性對(duì)應(yīng)物的lncRNA能編碼一些低保守性的短肽，所以推測(cè)circRNA也可以翻譯形成蛋白，而這一推測(cè)也被后續(xù)實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。研究表明，當(dāng)circRNA含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）或原核核糖體結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，就可以在體內(nèi)或體外翻譯成短肽[10]。例如，Pamudurti NR等[11]發(fā)現(xiàn)果蠅體內(nèi)一部分circRNA可以以不依賴(lài)于5＇端帽子結(jié)構(gòu)的方式進(jìn)行翻譯，編碼至少一個(gè)核糖體-circRNA特異性結(jié)構(gòu)域。類(lèi)似的，Legnini等[12]在小鼠和人成肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，circ-ZNF609的開(kāi)放閱讀框在環(huán)化時(shí)會(huì)產(chǎn)生一個(gè)與線性轉(zhuǎn)錄本相同的起始密碼子和終止密碼子，以不依賴(lài)于5＇端帽子結(jié)構(gòu)的方式翻譯產(chǎn)生蛋白，但是這個(gè)蛋白的活性需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。最近，Yang等[13]的實(shí)驗(yàn)表明，N6-腺苷酸甲基化（m6A）基序在許多circRNA中富集，并促進(jìn)不依賴(lài)于5＇端帽子結(jié)構(gòu)翻譯的開(kāi)啟。

3 結(jié)論

隨著對(duì)circRNA研究的不斷深入，circRNA的重要作用也日益凸顯。最近研究表明circRNA可以作為ceRNA,競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA、部分蛋白，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。這種ceRNA調(diào)控模式及circRNA自身的表達(dá)在真核生物中均具有較高穩(wěn)定性，這使他們具有作為標(biāo)志物檢測(cè)相關(guān)疾病的應(yīng)用前景。此外，circRNA與miRNA、部分蛋白的定向結(jié)合能力也暗示我們，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的時(shí)代，circRNA一定會(huì)在免疫治療方面發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步闡明circRNA的ceRNA調(diào)控網(wǎng)，使其為疾病治療效力，都只是時(shí)間問(wèn)題。circRNA的存在及功能拓展了真核生物轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性和多樣性，本文重點(diǎn)對(duì)circRNA的生物發(fā)生進(jìn)行了整理匯總，同時(shí)為更好地了解與治療人類(lèi)疾病提供理論依據(jù)與技術(shù)指導(dǎo)。