循環(huán)游離DNA在胰腺癌中的臨床應用進展

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(1復旦大學附屬中山醫(yī)院放射科 上海 200032; 2上海市影像醫(yī)學研究所 上海 200032;3復旦大學附屬中山醫(yī)院介入治療科 上海 200032)

循環(huán)游離DNA(circulating free DNA,cfDNA)是指存在于細胞外的血漿、血清以及其他體液中的核酸片段,1948年,Mandel等[1]首次在外周血中發(fā)現(xiàn)cfDNA的存在。健康人群cfDNA含量維持較低水平,而在炎癥、創(chuàng)傷等狀態(tài)下cfDNA的含量明顯較健康人群高[2-3]。1977年,Leon等[4]發(fā)現(xiàn),腫瘤患者的cfDNA水平明顯高于健康人群;而與非轉移性腫瘤對比,轉移性腫瘤患者具有更高的cfDNA水平。但直到1994年,人們才發(fā)現(xiàn)這種攜帶了突變信息的cfDNA是腫瘤的標志,cfDNA的研究才與腫瘤關聯(lián)起來[5]。

利用血液樣本檢測以及量化腫瘤突變的方法可被視為“液體活檢”,在腫瘤的早期診斷、預后評估、復發(fā)轉移監(jiān)測中擁有巨大的潛力[6-7]。本文就游離DNA的來源、檢測方法以及其在胰腺癌中的臨床應用進行綜述。

游離DNA的來源及特點游離DNA是游離于細胞外血液及體液中的脫氧核糖核酸片段。盡管其內(nèi)源性已經(jīng)被絕大多數(shù)學者接受,但其來源及釋放機制仍不清楚[8-9]。目前認為游離DNA主要來源于凋亡細胞,除此之外,正常的活細胞也可以主動釋放DNA片段。最近研究表明,游離DNA上的核小體可以用來追蹤游離DNA片段的起源[10]。腫瘤游離DNA片段主要來源于凋亡以及壞死的腫瘤細胞、循環(huán)腫瘤細胞(circulation tumor cells,CTCs)以及腫瘤細胞分泌的外排體[11]。腫瘤患者cfDNA中包含了腫瘤和正常細胞來源的DNA片段,其中來源于腫瘤的cfDNA稱為循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA),可以反映腫瘤組織的DNA特征[12]。通常來源于細胞壞死的DNA片段較來源于細胞凋亡的片段更大。這一特點被用來評估cfDNA中腫瘤來源的比例[13]。cfDNA在外周血中很快被清除,其半衰期從15 min到幾個小時,這使得cfDNA成為一個實時的標志物[9]。腫瘤細胞從原發(fā)病灶脫落,進入血液循環(huán)形成CTCs。最初的研究認為ctDNA是來自于CTCs,而在不能檢測到CTCs的患者中仍然可以檢測到ctDNA[14-15]。因此,ctDNA與CTCs是不同的。

cfDNA和ctDNA的檢測目前尚無標準的cfDNA提取方法,利用血漿還是血清、樣本采集中使用不同的抗凝劑,冷凍保存的時間差異等均會影響cfDNA的濃度[8,16]。利用血漿或血清都可以提取cfDNA,血清中cfDNA濃度較高的原因是血液凝結過程中白細胞破裂釋放了大量cfDNA,而這也使得腫瘤相關游離DNA的提取更加困難[17]。因此雖然血漿中DNA的水平低于血清,但利用血漿提取的DNA是研究腫瘤DNA的更好選擇[18]。cfDNA的濃度也隨著血漿或血清的保存時間延長而增加[19],這也對樣品的保存時間提出了要求,保存時間的不一致可能導致檢測結果的偏差。El等[16]研究分析前不同因素對cfDNA的影響并提出標準提取方法及純化步驟[16]。

cfDNA的檢測可分為定量和定性兩大類。由于巨噬細胞的清除作用,健康人群cfDNA含量維持較低水平[20]。而腫瘤患者由于腫瘤細胞壞死、播散所釋放的DNA超過了巨噬細胞的清除能力,因此cfDNA水平增高。而淋巴結轉移和/或遠處轉移患者的游離DNA水平更高,這也提示cfDNA水平與腫瘤負荷相關[21]。游離DNA定性檢測主要包括腫瘤特異性DNA的突變、重排以及甲基化。既往痕量的ctDNA水平限制了腫瘤特異性基因改變的檢測。而高度敏感和特異性的方法已經(jīng)被用來檢測ctDNA,主要包括檢測單核苷酸突變的BEAMing技術、微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR)技術、標記擴增測序(tagged amplication deep sequencing,Tam-Seq)技術和安全測序系統(tǒng)(secure sequencing system,Safe-SeqS),以及評估拷貝數(shù)變異的全基因組測序[22-25]。不同技術的優(yōu)勢及局限性也被廣泛討論[26-27]?？偟膩碚f,靶向方法較非靶向方法具有更高的靈敏度[27]。最近研究表明,超靈敏技術可以在“海量”cfDNA中檢測到最小量的ctDNA,在腫瘤的早期診斷或微小殘留灶檢測中發(fā)揮巨大的作用[28]。

cfDNA在胰腺癌中的臨床應用胰腺癌起病隱匿、進展迅速,早期診斷困難,多數(shù)患者確診時已屬晚期,手術切除率僅為10%～20%[29-30]?；熓歉纳浦型砥谝认侔┗颊哳A后的主要手段。胰腺癌患者的預后主要依賴于影像學分期、組織學分級及CA19-9水平[4-5,31]。在過去數(shù)十年中,胰腺癌的生存率并沒有明顯的改善[29]。尋找胰腺癌特異性的腫瘤標記物是早期診斷和改善預后的關鍵。cfDNA的定量和定性分析,可被視為一種“液體活檢”,具有無創(chuàng)、無損、實時、多次的優(yōu)點,在腫瘤早期診斷、監(jiān)測、預后判斷及個體化治療方面具有廣泛的前景。目前,胰腺癌cfDNA的檢測分析已展現(xiàn)出一定的臨床應用價值。

cfDNA定量檢測在胰腺癌中的價值 腫瘤細胞壞死釋放大量的DNA片段,因此腫瘤患者cfDNA水平明顯高于健康人群。研究顯示,健康人群血漿cfDNA水平為0～100 ng/mL,平均30 ng/mL,而腫瘤患者為0～1 000 ng/mL,平均180 ng/mL[32]。相關文獻報道,胰腺癌患者cfDNA水平為71.2 (15.0～240.0)ng/mL,而健康人為34.6(22.2～48.4)ng/mL,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.034)。進一步研究顯示,胰腺癌cfDNA的濃度與腫瘤的血管侵犯和轉移顯著相關(P=0.001、P=0.030),而與腫瘤的大小、淋巴結轉移和可切除性無關[33]。在胰腺癌與其他胰腺疾病的鑒別診斷方面,Sikora等[34]利用實時定量PCR的方法測定了50例胰腺導管腺癌、23例胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、20例慢性胰腺炎及23例健康志愿者的血漿cfDNA水平及完整性。結果顯示,胰腺導管腺癌患者cfDNA含量最高,與胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、慢性胰腺炎及健康志愿者相比,差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001)。Berger等[35]對24例胰腺導管腺癌、21例胰腺導管內(nèi)乳頭狀黏液瘤(intraductal papillary mucinous neoplasms,IPMN)及38例健康志愿者的cfDNA水平進行檢測。發(fā)現(xiàn)與IPMN及健康志愿者相比,胰腺導管腺癌的cfDNA水平最高,差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001)。分析上述研究發(fā)現(xiàn)cfDNA水平并不一致,提取和檢測方法的不同是導致結果差異的主要原因。cfDNA的檢測流程標準化將為其臨床應用奠定基礎。

cfDNA定性檢測在胰腺癌中的價值 腫瘤的發(fā)生是體細胞中多種基因改變和累積的結果。胰腺癌的發(fā)生與癌基因Kras,抑癌基因TP53、CDKN2A/p16及SMAD4的突變密切相關,超過90%的胰腺癌患者存在Kras基因突變[36-38]。因此患者的游離DNA中應該檢測到這些來源于腫瘤的突變。大量的研究結果表明胰腺癌患者的游離DNA中含有Kras突變[39-46],并且證明Kras基因突變可以用來監(jiān)測胰腺癌的發(fā)展。Dabritz等[43]對56例胰腺導管腺癌及13例胰腺炎患者的cfDNA中Kras基因突變進行檢測,發(fā)現(xiàn)其中20例胰腺導管腺癌中檢測到Kras突變,而在胰腺炎患者中均未檢測到Kras突變。而另外2項研究在13%(4/31)[42]和5%(2/37)[46]的慢性胰腺炎患者血漿中檢測到Kras突變,這些患者經(jīng)外科手術切除病變部位,術后病理均未檢測到胰腺癌,且在術后36個月的隨訪中,亦無檢測到Kras突變的慢性胰腺炎患者發(fā)展成為胰腺癌。短暫檢測出的Kras基因突變可能來源于增生的慢性炎性胰腺黏液細胞[47]。單獨檢測血漿Kras突變并不能作為診斷胰腺癌的可靠標志物,而與其他血清標志物聯(lián)合檢測,診斷敏感性顯著提高。有研究報道聯(lián)合檢測Kras突變和CA199對胰腺癌的診斷敏感性達91%[43]。

有研究將胰腺癌腫瘤大小與cfDNA中Kras突變對比,結果發(fā)現(xiàn)兩者之間無明顯相關性[46]。而另外一組研究則發(fā)現(xiàn)Kras基因突變和腫瘤大小具有相關性[41]。cfDNA中Kras基因突變還可以作為判斷胰腺癌預后的標志物。Castells等[45]和Chen等[46]研究發(fā)現(xiàn),cfDNA中Kras基因突變與胰腺癌的分級、轉移和生存率有關。Uemura等[44]在25例Ⅲ期胰腺癌外周血中檢測到5例Kras基因突變,而37例Ⅳ期胰腺癌中有25例檢測到Kras基因突變,這30例患者的生存期為6.3個月,明顯低于外周血中未檢測到Kras基因突變的患者(P<0.001)。而Singh等[33]研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌cfDNA中Kras基因突變與腫瘤的大小、血管侵犯、淋巴結轉移等病理因素無顯著相關性,也與患者的總體生存率無關。cfDNA還可以作為胰腺癌外科手術后監(jiān)測腫瘤殘余、復發(fā)的重要指標。Uemura等[47]發(fā)現(xiàn)9例胰腺癌患者中有5例在外科術后外周血中未檢測到Kras基因突變。Yamada等[41]研究了15例經(jīng)外科手術和/或化療的胰腺癌患者,其中12例外周血中Kras基因突變消失。

甲基化狀態(tài)異常也被認為與腫瘤的發(fā)生密切相關。目前已有多種基因被證實為胰腺癌的甲基化標志物[48]。Melnikov等[49]研究發(fā)現(xiàn)外周血中CCND2、SOCS1、THBS1、PLAU和VHL這5個甲基化基因的聯(lián)合檢測有助于胰腺癌的診斷,其敏感性為76%,特異性為59%。Liggett等[50]研究胰腺癌、慢性胰腺炎及健康志愿者各30例,鑒定出輔助鑒別診斷的17個甲基化基因,其中8個可鑒別正常志愿者和慢性胰腺癌(敏感性81.7%,特異性78%),14個可鑒別慢性胰腺炎和胰腺癌(敏感性91.2%,特異性90.8%)。Park等[51]對16例胰腺癌、13例慢性胰腺炎及29例健康志愿者cfDNA的UCHL1、NPTX2、SARP2、ppENK、p16和RASSF1A共6個甲基化基因進行檢測,結果發(fā)現(xiàn)81.3% (13/16)的胰腺癌、61.5% (8/13)的慢性胰腺炎及3.5% (1/29)健康志愿者中可以檢測到這些甲基化基因,其中p16基因的甲基化在胰腺癌和慢性胰腺炎的鑒別診斷中更加敏感。該研究還表明甲基化與吸煙史、腫瘤大小及分期無關。cfDNA甲基化狀態(tài)的檢測對胰腺癌的診斷和鑒別診斷具有一定的臨床應用價值。

微衛(wèi)星(microsatellite,MS)又稱短串聯(lián)重復序列,是一類廣泛存在于人類基因組的重復序列,一般為2～6個堿基。MS的改變包括不穩(wěn)定性和雜合性缺失,與腫瘤的發(fā)生密切相關。MS不穩(wěn)定性是腫瘤細胞特有的由于復制錯誤引起的遺傳性改變。雜合性缺失是雜合的等位基因變成純合性狀態(tài),從而導致抑癌基因的失活。1993年,Han等[52]發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織的癌細胞中存在MS DNA不穩(wěn)定性。針對胰腺癌的MS DNA檢測發(fā)現(xiàn),在cfDNA中檢測MS不穩(wěn)定性及等位基因失衡可能用于胰腺癌的診斷[53]。

cfDNA和CTCs的臨床應用對比 與cfDNA相似,CTCs同樣具有廣泛的臨床應用前景。2004年,美國FDA批準CellSearch系統(tǒng)用于轉移性乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌的外周血CTCs檢測。轉移性乳腺癌中外周血CTCs≥5個/7.5 mL提示預后較差[45]。胰腺癌相關研究顯示外周血CTCs水平可以作為胰腺癌患者的生存預測指標,但仍不是胰腺癌可靠的標志物[54]。CTCs還可以用于胰腺癌化療療效監(jiān)測以及個體化治療方案的選擇。

與ctDNA相比,CTCs提供完整的細胞,理論上可以基于DNA、RNA及蛋白質(zhì)進行檢測,從而更充分地了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。而外周血中CTCs含量低,檢測困難。應用CellSearch系統(tǒng),僅在20%的胰腺癌患者中檢測到CTCs[54-56]。門靜脈是胰腺癌CTCs血源性傳播的主要途徑。Catenacci等[57]對18例中晚期胰腺癌門脈及外周血CTCs進行比較,結果顯示門脈血CTCs為(118.4±36.8)個/7.5mL,而外周血僅為(0.8±0.4)個/7.5 mL。盡管利用單個CTCs可以研究腫瘤分子特征,但由于腫瘤內(nèi)部時空異質(zhì)性,多項研究表明CTCs與組織以及CTCs之間有很大差異,結果的穩(wěn)定性受到影響[58]。鑒于以上問題,ctDNA似乎能更好地了解腫瘤的突變。而隨著分子技術的不斷改進,兩者互補能提供更多的臨床信息。

結語隨著檢測技術的不斷進步及轉化醫(yī)學的迅速發(fā)展,cfDNA在胰腺癌診療過程中的作用日益受到重視。cfDNA因其檢測具有無創(chuàng)、無損、實時、可多次取材等優(yōu)勢而成為“液體活檢”的理想工具。發(fā)展快速、精準、低成本的cfDNA檢測技術以及進一步尋找特異性的胰腺癌ctDNA標志物,必將為胰腺癌患者的早期診斷及治療提供積極的幫助。

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