溶酶體組織蛋白酶參與宰后牛肉AIF介導(dǎo)細(xì)胞凋亡研究

張佳瑩　余群力　韓　玲　李　航　殷元虎　韓明山

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 蘭州 730070； 2.重慶恒都農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司， 豐都 408200；3.黑龍江畜牧獸醫(yī)研究所， 齊齊哈爾 161000； 4.內(nèi)蒙古科爾沁牛業(yè)股份有限公司， 通遼 028000)

0　引言

細(xì)胞凋亡已知有3條發(fā)生途徑：第1條途徑涉及細(xì)胞色素c (Cytochrome c, Cyt-c)的釋放及半胱氨酸蛋白酶家族(Caspase)效應(yīng)酶Caspase-3的激活，稱為內(nèi)源線粒體途徑；第2條由Caspase-8和Caspase-10的激活所介導(dǎo)，稱為外源死亡受體途徑；第3條，即激活Caspase-12介導(dǎo)凋亡的發(fā)生，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑[1]。宰后成熟過程中肉的嫩化是一個(gè)復(fù)雜的生化過程，而用細(xì)胞凋亡理論來解釋肉類宰后嫩化機(jī)制是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[2]。動物屠宰后，切斷了肌肉組織與外界環(huán)境的主要溝通，骨骼肌由于缺血缺氧而迅速發(fā)生細(xì)胞凋亡，這一凋亡過程依賴于內(nèi)源線粒體途徑。因此，線粒體途徑的研究仍然是肉類科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。ORRENIUS[3]表明線粒體對細(xì)胞凋亡的調(diào)控發(fā)揮至關(guān)重要的作用，指出位于線粒體內(nèi)膜的不同促凋亡蛋白釋放到胞漿中介導(dǎo)凋亡發(fā)生。

目前，線粒體途徑比較明確的是Cyt-c介導(dǎo)的Caspase依賴性途徑，即Cyt-c釋放到胞漿后，在dATP存在的條件下與凋亡相關(guān)因子-1(Apaf-1)結(jié)合，使其形成多聚體，并促使Caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體。Caspase-9被激活后活化下游效應(yīng)酶Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[4]。這條途徑在宰后成熟過程及細(xì)胞培養(yǎng)中都已得到廣泛的研究[5-6]。但是，在某些凋亡模型中，Caspase的廣譜抑制劑并不能完全阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生，由此出現(xiàn)了另外一條獨(dú)立于Caspase的線粒體凋亡途徑，即凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)途徑[7]。AIF能夠從線粒體中釋放并進(jìn)一步引發(fā)細(xì)胞核裂解。然而，在牛肉宰后成熟過程中，AIF是否發(fā)生了表達(dá)并介導(dǎo)細(xì)胞核發(fā)生凋亡，目前尚不清楚。

除線粒體外，研究表明溶酶體與凋亡信號密切相關(guān)[8]。在某些病理?xiàng)l件下或者細(xì)胞成熟老化過程中，溶酶體完整性受到破壞，造成溶酶體蛋白酶如組織蛋白酶的釋放，這些蛋白酶直接或間接導(dǎo)致線粒體膜通透性發(fā)生改變，使線粒體促凋亡因子釋放到胞質(zhì)中，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[9]。ZUZARTE-LUIS等[10]在研究胚胎細(xì)胞凋亡過程時(shí)發(fā)現(xiàn)，溶酶體組織蛋白酶有利于線粒體凋亡因子釋放到胞漿中，而組織蛋白酶D被認(rèn)為能夠誘導(dǎo)AIF的釋放。但是，溶酶體組織蛋白酶在宰后牛肉成熟期間是否被活化，其參與AIF激活的機(jī)制如何，國內(nèi)外未見報(bào)道。因此，有必要研究組織蛋白酶參與牛肉宰后成熟過程中AIF介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，為全面闡明線粒體途徑提供新機(jī)制。

因此，本文研究牛肉宰后成熟過程中活性氧(ROS)的生成、溶酶體膜完整性、組織蛋白酶活性、線粒體膜通透性、AIF的表達(dá)及細(xì)胞核形態(tài)的變化，從而確認(rèn)AIF是否在牛肉宰后成熟期間發(fā)生表達(dá)并介導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，組織蛋白酶是否被活化，最終明確組織蛋白酶參與AIF激活機(jī)制，以期為牛肉宰后成熟過程中細(xì)胞凋亡線粒體途徑提供更為全面的研究機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

試驗(yàn)材料：試驗(yàn)肉牛由甘肅康美現(xiàn)代農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司提供。選取發(fā)育正常、健康無病、體重均勻((450±50) kg)的2～3歲西門塔爾雜交牛6頭，宰前禁食16 h，禁水2 h。

試驗(yàn)試劑：Tris、Hepes、Anti-AIF抗體、Triton X-100、Z-Phe-Arg-AMC、Z-Phe-Arg-AMC、DCFH-DA、CHAPS，均屬色譜純，購于Sigma公司；蔗糖、醋酸鈉、半胱氨酸、NaCl、KCl、EDTA、甘露醇、血紅蛋白、Tween 20、顯影粉、定影粉、十二烷基磺酸鈉、酒石酸鉀鈉、丙烯酰胺，均屬分析純，購于天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

1.2　主要儀器設(shè)備

RF5301-PC型熒光分光光度計(jì)，日本島津公司；H2050R型冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Spectramax M2型酶標(biāo)儀，日本島津公司；YDS-10型恒溫水浴鍋，四川西亞化工有限公司；UV2550型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；JJ-2型高速組織搗碎機(jī)，江蘇金壇市億通電子有限公司；170-8280型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.3　試驗(yàn)方法

1.3.1樣本采集和制備

肉牛宰后30 min內(nèi)取其背最長肌為試驗(yàn)對象，隨后從背最長肌取下約15 g樣品，用錫箔紙包裹，立即放入液氮中，作為0 h的樣品。其余90 g肉樣真空包裝置于冰袋中，45 min內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于4℃條件下分別成熟6、12、24、72、120、168 h，作為常規(guī)成熟樣品。在每個(gè)成熟時(shí)間點(diǎn)，與0 h作相同的處理。所有樣本貯藏于-80℃待測。

1.3.2ROS含量

參照張玉林[11]的研究方法。0.5 g肌肉樣本放入3 mL緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L 蔗糖, 0.1 mmol/L EDTA-2Na, 0.008 g/mL NaCl, pH值7.4)中破碎，12 000 r/min勻漿1 min，勻漿液于3 000g、4℃離心15 min，收集上清液，雙縮脲法測定上清液蛋白濃度。隨后，取上清液100 μL，與100 μL反應(yīng)緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L 蔗糖, 0.1 mmol/L EDTA-2Na, 0.008 g/mL NaCl, 10 μmol/L DCFH-DA, pH值7.4)在酶標(biāo)板內(nèi)迅速混合，酶標(biāo)儀測定其熒光值。上述混合液于37℃孵育30 min后，測定其熒光值，ROS相對含量計(jì)算公式為

CROS=W(F2-F1)/FT

式中CROS——ROS相對含量，mg/(L·min)

F2——孵育后的熒光值

F1——孵育前的熒光值

FT——孵育時(shí)間，min

W——蛋白質(zhì)量濃度，mg/L

1.3.3溶酶體膜穩(wěn)定性

采用差速離心法分離肌肉組織溶酶體。1 g肌肉樣本置于預(yù)冷的0.25 mol/L蔗糖-Tris緩沖液中破碎，洗去殘余血液，加入9 mL蔗糖-Tris溶液勻漿，勻漿液于1 000g、4℃離心15 min，取上清液再于10 000g、4℃離心20 min，收集上清液，用于游離組織蛋白酶D的測定(表示溶酶體外的酶活性)。用0.1%Triton X-100重新懸浮沉淀物，置37℃加熱30 min，再于10 000g、4℃離心20 min，取上清液用于測定結(jié)合的組織蛋白酶D活性(表示存在于溶酶體內(nèi)的酶活性)，計(jì)算游離酶活性與結(jié)合活性兩者之間的百分比，即溶酶體膜穩(wěn)定性。

1.3.4組織蛋白酶活性

參照TIAN等[12]方法，并稍作修改。50 g肌肉樣本切碎后置于2倍體積預(yù)冷勻漿液(50 mmol/L醋酸鈉，pH值5.0,含7 mmol/L半胱氨酸，0.9 mmol/L苯甲基磺酰氟)中，勻漿后攪拌2 h并于12 000g、4℃離心30 min，收集上清液貯藏于-80℃用于組織蛋白酶活性測定。采用雙縮脲法測定蛋白濃度。組織蛋白酶L、B活力測定方法如下：反應(yīng)體系由298 μL反應(yīng)混合液(16 μL 0.05 g/mL Brij-35, 6 μL 0.05 g/mL CHAPS, 1 μL 1.4 mol/L 2-巰基乙醇, 5 μL熒光底物，70 μL 0.4 mmol/L 乙酸，200 μL蛋白提取液)組成。40℃水浴2 min后加入熒光底物Z-Phe-Arg-AMC (L)和Z-Phe-Arg-AMC (B)。反應(yīng)30 min后加入3.0 mL 0.1 mol/L的乙酸鈉終止反應(yīng)，在激發(fā)波長380 nm、發(fā)射波長460 nm條件下測定熒光強(qiáng)度。酶活力單位(U)定義為每分鐘內(nèi)催化1 μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。組織蛋白酶D活力測定方法如下：反應(yīng)體系由1 000 μL反應(yīng)混合液(250 μL 0.02 g/mL血紅蛋白，250 μL 0.2 mmol/L 乙酸，500 μL蛋白提取液)組成。37℃反應(yīng)30 min后加入125 μL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，595 nm處測定吸光度。酶活力單位(U)用每分鐘每克肉樣的吸光度來表示。

1.3.5線粒體膜通透性

參照陳騁等[13]的方法。10 g肉樣切碎后加入100 mL分離液(250 mmol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH值7.4)，12 000 r/min轉(zhuǎn)速下勻漿2 min，于1 500g、4℃離心15 min，收集上清液再次在12 000g、4℃條件下離心20 min，所得沉淀即為線粒體。將線粒體沉淀與5 mL測試介質(zhì)(230 mmol/L甘露醇、70 mmol/L蔗糖和3 mmol/L Hepes，pH值7.4)混合，使用前用測試介質(zhì)稀釋至3 mg/mL蛋白質(zhì)量濃度。迅速將稀釋好的線粒體溶液300 μL加入到2 700 μL測定介質(zhì)中，25℃孵育3 min后，以3 mL測定介質(zhì)作為對照，于540 nm波長下測定吸光度。

1.3.6AIF蛋白表達(dá)

采用12.5%的分離膠和4%的濃縮膠。取蛋白樣品上樣，每條泳道上樣100 μg總蛋白，電泳分離后將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，PVDF膜在含5%脫脂奶粉的TTBS (0.05% Tween 20, 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KCl, pH值7.5)溶液中室溫(20℃)下封閉1 h。加入適量一抗，于4℃下反應(yīng)12 h。將膜取出放入TBST洗膜盒中，在室溫條件下清洗3次，每次10 min，隨后采用1∶3 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體于室溫條件下孵育1 h，再次清洗3次，將其放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。

1.3.7細(xì)胞核HE染色

不同成熟時(shí)間點(diǎn)的樣本在10%的福爾馬林溶液中固定24 h，脫水、石蠟包埋后切成10 μm的組織切片，固定于經(jīng)APES包被的載玻片上，晾片5 min后蘇木精染色3 min，二甲苯通透，中性樹膠封片。制備好的玻片在顯微鏡下進(jìn)行觀察，并對細(xì)胞核形態(tài)進(jìn)行拍照。

1.3.8統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析(P<0.05)，Origin 8.0軟件制圖。所有結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，至少重復(fù)3次。

2　結(jié)果與分析

2.1　ROS相對含量

由圖1可知，牛肉在宰后成熟過程中ROS相對含量呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢。宰后6 h，ROS相對含量顯著降低(P<0.05)，隨著成熟時(shí)間的延長，ROS相對含量呈現(xiàn)升高的趨勢(P<0.05)，直至宰后120 h后無顯著變化。

圖1　牛肉宰后成熟過程中ROS相對含量變化Fig.1　Changes in ROS content of bovine muscle during postmortem aging

2.2　溶酶體膜穩(wěn)定性

由圖2可知，宰后牛肉成熟過程中溶酶體膜穩(wěn)定性呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。宰后0～6 h，溶酶體膜穩(wěn)定性沒有顯著差異，隨著宰后成熟時(shí)間的增加，溶酶體膜穩(wěn)定性顯著降低(P<0.05)。

2.3　組織蛋白酶活性

由圖3可知，牛肉宰后成熟過程中組織蛋白酶B、D和L的活力呈上升的趨勢。宰后0～6 h，組織蛋白酶活力均無顯著性變化，隨著成熟時(shí)間的延長，三者的活力均顯著升高 (P<0.05)。組織蛋白酶B活力從宰后0 h的134.75 U上升至宰后168 h的219.28 U，組織蛋白酶D活力從宰后0 h的0.173 U上升至宰后168 h的0.829 U，組織蛋白酶L活力從宰后0 h的1 484.13 U上升至宰后168 h的1 923.39 U。

圖2　牛肉宰后成熟過程中溶酶體膜穩(wěn)定性變化Fig.2　Changes in lysosomal membrane stability of bovine muscle during postmortem aging

圖3　牛肉宰后成熟過程中組織蛋白酶B、組織蛋白酶D和組織蛋白酶L活力變化Fig.3　Changes in cathepsins B, D and L activities of bovine muscle during postmortem aging

2.4　線粒體膜通透性

圖4　牛肉宰后成熟過程中線粒體膜通透性變化Fig.4　Changes in mitochondrial membrane permeability of bovine muscle during postmortem aging

由圖4可知，線粒體懸浮液在520 nm處的吸光度呈現(xiàn)降低的趨勢，說明牛肉宰后成熟過程中線粒體膜通透性逐漸增大。宰后0～6 h，線粒體膜通透性變化不顯著，6～12 h線粒體膜通透性顯著升高 (P<0.05)，之后隨著成熟時(shí)間的延長，線粒體膜通透性呈增大的趨勢，但變化并不顯著。

2.5　凋亡誘導(dǎo)因子蛋白表達(dá)

由圖5可知，宰后0～12 h牛肉中AIF(凋亡誘導(dǎo)因子)在線粒體中的表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，而在宰后12～168 h的成熟時(shí)間中，AIF的表達(dá)量顯著降低。宰后牛肉成熟過程中AIF在細(xì)胞核中的表達(dá)量呈上升的趨勢。宰后6 h沒有顯著變化，6～12 h顯著增加(P<0.05)，在隨后的成熟時(shí)間里基本沒有顯著變化。

2.6　細(xì)胞核形態(tài)

由圖6可知，采用HE染色法對宰后成熟過程中的牛肉細(xì)胞核進(jìn)行檢測，DAPI染料將細(xì)胞核標(biāo)記為藍(lán)色熒光。宰后0～168 h成熟過程中，細(xì)胞核體積逐漸增大，部分核溶解，并伴隨著細(xì)胞皺縮、細(xì)胞間隙變大的現(xiàn)象。

圖5　牛肉宰后成熟過程中凋亡誘導(dǎo)因子表達(dá)分析Fig.5　Western blotting analysis of relative changes in expression of AIF of bovine muscle during postmortem aging

圖6　牛肉宰后成熟過程中細(xì)胞核形態(tài)變化Fig.6　Changes in nuclear morphology of bovine muscle during postmortem aging

3　討論

近年來，由于線粒體Caspase依賴性途徑與宰后肉類嫩化密切相關(guān)，因此成為研究的熱點(diǎn)。盡管之前有研究報(bào)道了宰后成熟過程中Cyt-c介導(dǎo)的Caspase依賴性線粒體途徑[14-15]，但是線粒體凋亡途徑是極其復(fù)雜的，因此宰后成熟過程中牛肉骨骼肌的凋亡途徑及機(jī)制仍存在爭議。線粒體除釋放Cyt-c外，還能釋放其它蛋白(如AIF)誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。那么，牛肉在宰后成熟過程中，線粒體AIF蛋白是否被激活從而介導(dǎo)凋亡的發(fā)生，組織蛋白酶是否被活化，其參與AIF激活的機(jī)制如何，目前并不清楚。因此本文旨在研究牛肉宰后成熟過程中組織蛋白酶參與AIF釋放及線粒體AIF激活并介導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生的機(jī)制。

ROS的產(chǎn)生是不可避免的，宰后成熟過程引起細(xì)胞內(nèi)ROS的增加，使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。本試驗(yàn)中，宰后6 h ROS相對含量降低，可能與肌細(xì)胞中抗氧化酶的存在有關(guān)。宰后初期，細(xì)胞液中的谷胱甘肽還原系統(tǒng)及超氧化物歧化酶會清除部分ROS，而隨著成熟時(shí)間的延長，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境逐漸惡化，抗氧化酶活性降低甚至完全失活，還原系統(tǒng)也遭到破壞，導(dǎo)致后期ROS在細(xì)胞的大量堆積[16]。此外，ROS在概念上類似于其他信號物質(zhì)，如Ca2+。Ca2+能夠作用于線粒體，影響其通透性的改變，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。同樣，ROS的大量累積，造成組織器官失常，誘導(dǎo)凋亡發(fā)生[17]。WANG等[18]在研究線粒體凋亡因子對宰后成熟過程中牦牛肉嫩度影響時(shí)表明，宰后成熟過程中ROS的含量顯著增加，改變了線粒體電子呼吸鏈，加速了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。CAI等[19]指出在多種細(xì)胞凋亡因素的刺激下，細(xì)胞內(nèi)ROS的增加導(dǎo)致溶酶體膜通透和細(xì)胞死亡。因此，宰后成熟過程中牛肉細(xì)胞ROS含量增加，可能刺激溶酶體膜穩(wěn)定性發(fā)生變化。

研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體在細(xì)胞凋亡中起著重要作用。在氧化應(yīng)激條件下，溶酶體酶能夠激活細(xì)胞凋亡酶，預(yù)示著溶酶體參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，至此，溶酶體在細(xì)胞凋亡過程中的重要作用才得到廣泛的關(guān)注[20]。溶酶體誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵步驟是溶酶體膜失穩(wěn)，導(dǎo)致溶酶體蛋白酶釋放到胞漿中啟動凋亡的發(fā)生。本文研究結(jié)果表明，宰后牛肉成熟過程中，溶酶體膜的穩(wěn)定性逐漸降低。REPNIK等[21]研究表明造成溶酶體膜穩(wěn)定性失衡的因素有很多，其中研究最廣泛的就是ROS。組織蛋白酶存在于溶酶體細(xì)胞器中，幫助維持細(xì)胞新陳代謝。當(dāng)溶酶體膜失穩(wěn)后，組織蛋白酶釋放到胞漿中，啟動溶酶體凋亡通路。本試驗(yàn)結(jié)果表明，組織蛋白酶B、D和L的活力隨著宰后成熟時(shí)間的延長顯著增大。這可能是由于組織蛋白酶是一種存在于溶酶體中的酶。宰后初期，因?yàn)槠錄]有完全從溶酶體中釋放出來，所以活性較低。隨著成熟時(shí)間的延長，溶酶體膜穩(wěn)定性被破壞，組織蛋白酶隨之從溶酶體中釋放出來，活性升高。這與田甲春[22]研究結(jié)果相一致。此外，溶酶體膜的損傷會選擇性釋放一些組織蛋白酶，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此，宰后成熟過程中牛肉溶酶體膜穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致組織蛋白酶從溶酶體釋放出來從而被活化，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡反應(yīng)的發(fā)生。

溶酶體組織蛋白酶凋亡途徑，被認(rèn)為是通過線粒體進(jìn)行的[23]。而線粒體膜通透性是線粒體釋放相關(guān)蛋白的關(guān)鍵步驟。本文研究結(jié)果表明，隨著宰后成熟時(shí)間的延長，線粒體膜通透性逐漸增大。這一結(jié)果與HOFER等[24]在研究動物宰后成熟時(shí)期線粒體膜通透性變化結(jié)果相一致。宰后6～12 h，線粒體膜通透性變化顯著，可能與這一時(shí)間段是凋亡相關(guān)蛋白釋放的主要時(shí)期有關(guān)。ZHANG等[25]在研究牛肉宰后成熟過程Cyt-c介導(dǎo)凋亡發(fā)生時(shí)也認(rèn)為，線粒體膜通透性隨著成熟時(shí)間的延長而增大，這與Cyt-c的釋放密切相關(guān)。同時(shí)，SUN等[26]研究認(rèn)為組織蛋白在細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡發(fā)生是通過線粒體膜的通透和AIF的核轉(zhuǎn)位來實(shí)現(xiàn)的。

對于凋亡組織而言，線粒體膜發(fā)生通透，AIF從線粒體移位到細(xì)胞核中，誘導(dǎo)細(xì)胞核發(fā)生凋亡。AIF在多種死亡過程中作為一種重要的誘導(dǎo)因子[27]。與這一理論相一致，本文研究結(jié)果表明，宰后成熟過程中牛肉AIF從線粒體釋放到細(xì)胞核中，活化的AIF誘導(dǎo)細(xì)胞核發(fā)生凋亡。宰后0～12 h，AIF在線粒體中的表達(dá)量增加，可能是線粒體AIF的生成速度大于釋放速度。宰后12～168 h，AIF在線粒體中的表達(dá)量減少，這與其在細(xì)胞核中的表達(dá)量增加相一致。TERMAN等[28]研究表明溶酶體組織蛋白酶有利于線粒體AIF釋放到胞漿中，繼而進(jìn)入核內(nèi)，誘發(fā)細(xì)胞核發(fā)生變化，這一過程甚至發(fā)生在細(xì)胞凋亡酶未被激活的情況下。JOHANSSON等[29]研究也表明釋放到胞質(zhì)中的組織蛋白酶又能夠促進(jìn)線粒體中AIF及Cyt-c的釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡。

4　結(jié)束語

牛肉宰后成熟過程中ROS相對含量先降低后升高，溶酶體膜穩(wěn)定性降低，組織蛋白酶B、D和L的活力逐漸增大，線粒體膜通透性增大，AIF從線粒體釋放到細(xì)胞核中，細(xì)胞核體積增大，部分核溶解，并伴隨著細(xì)胞間隙變大的現(xiàn)象。說明牛肉在宰后成熟過程中生成ROS，ROS的累積導(dǎo)致溶酶體膜穩(wěn)定性失衡，使組織蛋白酶被釋放，作用于線粒體，隨后線粒體膜通透性發(fā)生變化，釋放AIF，活化的AIF進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。

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