生物炭對華北冬小麥根系形態(tài)和內生真菌多樣性的影響

李瑞霞　李洪杰　霍艷麗　高　悅　楊正禮　張愛平

(1.中國農業(yè)科學院農業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所， 北京 100081； 2.河北經(jīng)貿大學旅游學院， 石家莊 050061；3.山東省德州市農業(yè)科學院， 德州 253015； 4.河北北方學院基礎醫(yī)學院， 張家口 075000)

0　引言

華北平原是我國重要的糧食產(chǎn)區(qū)，冬小麥-夏玉米秸稈還田是該區(qū)秸稈利用的主要方式。大量試驗結果表明，秸稈直接還田有效改善土壤結構、促進作物生長和提高土壤固碳減排能力[1]，但也導致作物出苗率下降[2-3]以及病蟲害增加[4-5]等風險。近年來，秸稈炭化還田作為促進農業(yè)低碳循環(huán)和可持續(xù)發(fā)展的新型還田方式日益成為學術界的研究熱點。

內生真菌是指在其生活史的部分或全部階段生活于植物組織內，對植物沒有引起明顯病害癥狀的真菌[6]。叢枝菌根真菌是大多數(shù)陸生植物和根內真菌的共生體[7]，可促進宿主植物的生長和發(fā)育。有關生物炭對其的影響已有大量研究，結果表明生物炭可增強作物根部真菌繁殖能力，提高菌根真菌侵染量[8-13]。內生真菌影響植物生長性狀的特點與菌根真菌類似，如促進植物營養(yǎng)生長、增強光合作用、增加生物量(產(chǎn)量)、提高在逆境中的生存能力[14-15]以及增加對磷的吸收和貯存[16-18]。內生真菌存在相對減少了叢枝菌根真菌對植物的貢獻[19]，還可能影響根的構型和生物量。研究發(fā)現(xiàn)，內生真菌降低了AMF侵染率和根的生物量[20]，內生真菌侵染導致高羊茅根毛增長，根半徑減小[16]。小麥是我國第二大糧食作物，研究內生真菌與根共生關系，對于發(fā)掘利用對小麥有益的內生真菌資源，控制潛在有害內生真菌，促進小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。

小麥根系由初生根和次生根組成，其建成時期和功能各異。小麥的初生根分布深，對小麥的抗旱能力起著至關重要的作用[21-23]，尤其在虧缺灌溉下，初生根對生育后期供水起決定性作用[24]。小麥的次生根分布淺，在拔節(jié)至孕穗期間主要吸收利用淺層水[24]。賈銀鎖等[25]通過15N示蹤技術對小麥不同單位根系特性、功能的研究表明，盡管小麥生長后期，次生根系的生長占了主導地位，但是初生根的作用仍然不能忽視。在土壤系統(tǒng)中，生物和非生物因子共同調控作物根系構型。目前，從根系類型角度研究小麥根系與內生真菌的共生機制對生物炭的響應尚未見報道。因此，本研究以冬小麥為研究對象，以常規(guī)秸稈還田為對照，對比研究不同生物炭用量對冬小麥根系形態(tài)和內生真菌多樣性的影響及其共生機制，旨在確定施用生物炭的最佳比例，為生物炭在農田土壤改良和小麥綠色生產(chǎn)應用提供科學依據(jù)。

1　試驗材料與方法

1.1　試驗設計

試驗點位于山東省德州市平原縣黃河涯鎮(zhèn)德州市現(xiàn)代農業(yè)科技園試驗基地，德州市平原縣屬暖溫帶半干旱地區(qū)，土壤類型為砂壤土，年平均降水量547.50 mm，主要集中在6—8月，年平均氣溫12.90℃，平均無霜期為206 d，年積溫4 639℃。施用生物炭前試驗田耕層(0～20 cm)有機質質量比13.17 g/kg，堿解氮、有效磷和速效鉀質量比分別為26.56、34.27、106 mg/kg，pH值為8.54。所用生物質炭以棉花秸稈為原料燒制，由山東省濟南宸銘環(huán)衛(wèi)設備有限公司提供。該生物質炭全氮、全磷、全鉀質量比分別為4.88、0.83、15.98 g/kg，pH 值為7.78。

采用田間試驗法，以常規(guī)秸稈粉碎翻壓還田(還田量15 891.98 kg/hm2)為對照(CK)，設3個處理：C1(4.5 t/hm2)、C2(9.0 t/hm2)和C3(13.5 t/hm2)。冬小麥播前玉米秸稈全部移除，施入生物炭后旋耕。采取隨機區(qū)組設計，3次重復，每個小區(qū)長寬為15 m×6 m，小區(qū)間隔1 m，共計12個小區(qū)。種植制度為冬小麥-夏玉米輪作，供試冬小麥品種為濟麥22，2015年11月6日播種，2016年6月5日收獲。采用機械播種，播種量為300 kg/hm2，行距為17.5 cm。各處理冬小麥季施氮(N)和磷(P2O5)分別為315、270 kg/hm2，其中氮肥按照基肥和拔節(jié)期追肥1∶1比例施入，磷肥做底肥一次性施入。灌水、除草和噴藥等措施同常規(guī)田間管理。

1.2　測定方法

1.2.1根系形態(tài)測定

冬小麥成熟期根系開始老化，SUN等[26]研究發(fā)現(xiàn)，較老的植物組織由于發(fā)生表皮降解等變化，而有利于內生真菌侵染過程的實現(xiàn)，故而選擇冬小麥成熟期，在每個小區(qū)中間部位隨機選取生長均勻一致的植株，以莖干為中心，1/2行距處，用平板利鏟挖(長寬深分別為20、17.5、20 cm)3個土塊，根系樣品用清水洗凈，每個土塊選擇5株完整根系。按照根系生長發(fā)育部位分為初生根和次生根兩部分，采用 WinRHIZO(Pro2005c)型根系掃描儀及其數(shù)據(jù)分析軟件，結合 Epson Expression10 000 XL 圖像掃描系統(tǒng)對根系平均直徑、總根長和分支數(shù)進行分析。掃描完后，按照根系分類進行標記，用濾紙包好，在65℃下干燥至恒質量，用電子天平(±0.000 1 g)稱量。比根長指單位根系質量的根長(單位：m/g)，分支密度是指單位根長上的分枝數(shù)(單位：枝/cm)。

1.2.2根系內生真菌ITS高通量測序

將采集到的冬小麥根系，用自來水沖洗干凈，將根表面水分用濾紙吸干，按生長發(fā)育部位分為初生根和次生根，分別浸泡于1%次氯酸鈉溶液中 50 s，無菌水沖洗3次，再浸泡于75%乙醇溶液1 min，用無菌水沖洗3次，進行表面消毒滅菌。濾紙吸干后，再剪成 0.5 cm×0.5 cm的根段，置于無菌袋并保存于-80℃?zhèn)溆谩８鶚铀椭帘本W維森基因科技有限公司，進行基因DNA提取、PCR擴增、熒光定量，并應用Illumina MiSeq 平臺對內生真菌基因ITS1進行測序。

通過Illumina MiSeq 平臺進行Paired-end測序，下機數(shù)據(jù)經(jīng)過QIIME(V1.8.0)軟件過濾、拼接、去除嵌合體，再調用Uclust德爾方法[27]對優(yōu)質序列按相似度大于等于97%進行OTU的聚類，選取每個類最長的序列為代表序列。然后調用RDP-classifier(Version 2.2，http:∥sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)數(shù)據(jù)庫對OTU代表序列進行物種注釋分析，最終得到每個OTU分類學信息。對于不符合以上標準的 OTU 歸為“未分類真菌門”。根據(jù)物種注釋結果，選取在門(Phylum)和優(yōu)勢目(Order)分類水平上各物種相對豐度分布做柱形圖。利用 mothur 軟件(version 1.31.2)計算內生真菌多樣性指數(shù)，Chao1豐富度指數(shù)計算公式為

式中Sobs——檢測到的所有OTU總數(shù)

N1——只有一條序列的OTU數(shù)目

N2——只有兩條序列的OTU數(shù)目

Shannon多樣性指數(shù)計算公式為

SShannon=-∑(ni/N)lnni/N

式中ni——各分類單元中包含的序列數(shù)

N——所有數(shù)列之和

1.3　數(shù)據(jù)分析方法

采用 SPSS 16.0 (SPSS Inc.，Chicago, IL, Version 16.0)對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，采用 Duncan 多重檢驗法對各個處理在0.05水平進行差異顯著性檢驗。采用Canoco for Window 4.5進行 RDA冗余分析，揭示不同類型根系形態(tài)與其內生真菌群落組成的關系。

2　結果與分析

2.1　生物炭對冬小麥成熟期根系形態(tài)和生物量的影響

冬小麥初生根與次生根的形態(tài)和生物量對生物炭的響應見表1。初生根總根長、直徑和生物量明顯低于次生根，初生根比根長卻明顯高于次生根。分支密度在對照中兩類根差異不顯著，但在生物炭處理中初生根明顯低于次生根?？梢姡瑑深惛瞪L特性不同，對生物炭的響應也存在差異。

表1　不同處理下根系形態(tài)和生物量Tab.1　Root morphology and biomass in different treatments

注：數(shù)據(jù)形式為平均值±標準差，a、b代表不同處理之間的差異性，x、y代表不同類型根系之間的差異性，下同。

由表1可知，各處理初生根總根長與對照差異不顯著；次生根總根長僅C3處理顯著高于對照處理7.80%。C1、C2、C3處理的初生根直徑顯著高于對照10%、5%、5%；僅C2處理次生根直徑顯著低于對照13.16%，而C1、C3處理均與對照處理差異不顯著。C1、C2、C3處理中兩類根分支密度顯著低于對照處理，其中初生根降幅分別為65.48%、67.26%、83.33%，次生根降幅分別為30.00%、34.38%、45.63%。C1、C2、C3處理中初生根比根長顯著高于對照處理27.10%、33.57%、68.56%；僅C3處理中次生根比根長顯著低于對照處理37.35%，C1、C2處理與對照處理差異不顯著。C1、C2、C3處理中初生根生物量顯著低于對照處理18.18%、27.27%、36.36%；C3處理次生根生物量顯著高于對照處理66.67%，而C1、C2 處理與對照處理差異不顯著。

由表2可知，生物炭施用量4.5～9.0 t/hm2時，冬小麥產(chǎn)量顯著增加19.49%～28.14%，其中C2處理的有效穗數(shù)和產(chǎn)量均顯著高于對照處理，分別增加10.60%、28.14%。生物炭施用量4.5～13.5 t/hm2的各處理下穗粒數(shù)和千粒質量出現(xiàn)增加趨勢，但均未達到顯著水平?？梢?，施用生物炭提高有效穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒質量是增產(chǎn)的主要原因，說明適宜的生物炭用量對提高冬小麥產(chǎn)量有重要作用。

表2　不同處理下冬小麥產(chǎn)量和產(chǎn)量構成因素Tab.2　Winter wheat yield and its components in different treatments

2.2　生物炭對冬小麥成熟期根內生真菌多樣性和群落組成的影響

由表3可知，與對照處理相比，C1、C2處理降低了兩類根內豐富度Chao1指數(shù)，但未達到顯著水平，僅C3處理顯著降低兩類根內Chao1指數(shù)。生物炭顯著降低了兩類根內生真菌多樣性Shannon指數(shù)。比較初生根與次生根內生真菌豐富度Chao1指數(shù)發(fā)現(xiàn)，各處理中差異均不顯著。多樣性Shannon指數(shù)在CK中初生根顯著低于次生根，在C1、C2處理中初生根顯著高于次生根，C3處理中兩者差異不大。

表3　不同處理根系內真菌群落多樣性指數(shù)Tab.3　Root endophytic fungal community diversity index in different treatments

圖1　不同處理根系內生真菌門和目水平(子囊菌門和接合菌門的常見目)相對豐度Fig.1　Proportions of root endophytic fungal phyla and common fungal orders within Ascomycota and Zygomycota in different treatments

圖1為兩類根各處理在門和目2個分布水平的真菌群落的豐度。由圖1a可知，在門分布水平上構成冬小麥灌漿后期初生根內的優(yōu)勢真菌群落為子囊菌門，占初生根全部群落的74.76%。其他為擔子菌門(Basidiomycota)、接合菌門、壺菌門和球囊菌門。與對照處理相比，C1、C2處理使子囊菌門豐度顯著提高了40.21%、46.20%，C3處理僅提高3.37%，與對照差異不顯著。C3處理擔子菌門豐度顯著高于對照120.59%，而C1、C2處理卻分別顯著低于對照處理57.85%、58.62%。同時，施用生物炭極大地降低了接合菌門、壺菌門和未鑒定雜菌豐度，對球囊菌門豐度影響不大。在常見目分布水平上，對照處理優(yōu)勢菌是肉座菌目(Hypocreales)、糞殼菌目(Sordariales)和格孢菌目，豐度分別占12.69%、13.15%、16.94%；而C1、C2、C3處理優(yōu)勢菌均是格孢菌目，豐度分別為26.52%、31.82%、23.97%。與對照處理相比，C1、C2處理顯著提高了肉座菌目、糞殼菌目、巨座殼目(Magnaporthales)和格孢菌目豐度，C3處理僅顯著提高巨座殼目和格孢菌目豐度；C1、C2、C3處理顯著降低了散囊菌目和被孢霉目豐度，其中C3處理還顯著降低了肉座菌目豐度。

由圖1b可知，冬小麥次生根中內生真菌群落組成同初生根。在門分布水平上次生根中的優(yōu)勢菌門也為子囊菌門，占次生根全部群落的88.47%。與對照處理相比，C1、C2、C3處理的子囊菌門豐度顯著提高16.40%、21.62%、19.08%。C2處理的擔子菌門豐度比對照顯著提高66.34%，C1、C3處理分別顯著降低17.82%、68.32%。施用生物炭還顯著降低接合菌門、壺菌門和未鑒定雜菌豐度，對球囊菌門豐度影響不大，與初生根中表現(xiàn)一致。在常見目分布水平上，對照處理優(yōu)勢菌，糞殼菌目豐度占25.06%；而C1、C2、C3處理優(yōu)勢菌目均是格孢菌目，豐度分別為31.40%、37.81%、41.80%。與對照處理相比，C1、C2、C3處理顯著提高格孢菌目豐度，而C1、C3處理還顯著提高了巨座殼目豐度；C1、C2、C3處理顯著降低了散囊菌目和被孢霉目豐度，而C1、C2處理還顯著降低了糞殼菌目豐度， C1、C3處理顯著降低了肉座菌目豐度。

2.3　生物炭處理下冬小麥成熟期根系形態(tài)和內生真菌菌群豐度的相關性

RDA分析如圖2所示，其中As：Ascomycota；Ba：Basidiomycota； Zy：Zygomycota；Chy：Chytridiomycota；Gl：Glomeromycota；Un：Unidentified fungus；Hy：Hypocreales；So：Sordariales；Ma：Magnaporthales；Pl：Pleosporales；Eu：Eurotiales；Mo：Mortierellales；TL：總根長；D：直徑；B：生物量；RBD：分支密度；SRL：比根長；T：處理(黑色字體代表根系形態(tài)，紅色字體代表根內生真菌)。表明在門水平上，初生根內生真菌群落可以解釋同類根系形態(tài)變異的9.69%；在常見目分布水平上，可以解釋根系形態(tài)變異的10.31%。經(jīng)蒙特卡洛999次檢驗可知，初生根形態(tài)受接合菌門、散囊菌目和被孢霉目真菌的顯著影響。由圖2a可知，初生根內接合菌門、散囊菌目和被孢霉目真菌豐度與初生根分支密度和生物量呈顯著正相關，與總根長、直徑和比根長呈顯著負相關。在門水平上，次生根內生真菌群落可以解釋同類根系形態(tài)變異的14.26%；在常見目水平，可以解釋根系形態(tài)變異的9.36%。經(jīng)蒙特卡洛999次檢驗可知，次生根形態(tài)受格孢菌目和散囊菌目真菌的顯著影響。由圖2b可知，次生根內格孢菌目真菌豐度與生物量呈顯著正相關，與直徑、分支密度和比根長呈顯著負相關。

圖2　根系形態(tài)指標和內生真菌群落結構的RDA分析Fig.2　RDA analysis between root morphology index and proportions of root endophytic fungal community structure

3　討論

3.1　生物炭對冬小麥根系形態(tài)和生物量的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，施用生物炭后兩類根的總根長變化不大，分支密度降低，說明增加了單根長度。施用生物炭后冬小麥初生根直徑明顯變大，延緩了生育后期根系衰亡，有利于提高初生根對深層水分和養(yǎng)分的轉運效率。僅C2處理次生根直徑顯著減小，壽命縮短，提升了吸收能力。初生根和次生根的結構優(yōu)化，有利于增強后期根系對水分、養(yǎng)分等物質的持續(xù)供應能力，促進地上部生物量積累和產(chǎn)量形成。這與李中陽等[28]通過田間試驗發(fā)現(xiàn)，生物質炭各處理對拔節(jié)期冬小麥根系平均直徑、總根長和總表面積的增加均有促進作用的結果不同。這可能與小麥所處的生育時期、土壤類型和生物炭類型以及生物炭用量不同有關。

本研究發(fā)現(xiàn)，施用生物炭導致初生根比根長顯著增加，次生根比根長降低。說明生物炭增強了初生根吸收水分養(yǎng)分能力，降低了次生根吸收水分養(yǎng)分能力。本研究中生物炭施用量9.0 t/hm2時，在成熟期初生根生物量降低，直徑縮小，加快了次生根死亡速度，說明適宜施用生物炭減少了成熟期根的生長冗余，使光合產(chǎn)物更多地向籽粒分配。這與張偉明等[29]研究生物炭可能降低水稻灌漿期的根冠比，有利于提高根系吸收效率，促進地上部植株生長的結果類似。李中陽等[28]研究發(fā)現(xiàn)，生物炭對冬小麥的有效穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒質量的提高均有促進作用，以40 t/hm2的處理增產(chǎn)最多，但隨著生物炭施用量的增加，產(chǎn)量反而有所降低，但仍然高于對照處理，這與本研究結果一致。生物炭施用量13.5 t/hm2時，導致次生根總根長和生物量明顯增加，需要消耗大量的光合產(chǎn)物，故而導致產(chǎn)量降低。有研究表明，生物炭應用在砂質和砂質壤土不僅增加根生物量，而且通過優(yōu)化根系結構，形成發(fā)達根系，提高了抗干旱能力[30]。可見，適量的生物炭通過優(yōu)化根系形態(tài)對作物產(chǎn)量的增加起到促進作用。

3.2　生物炭對根內真菌群落組成和多樣性的影響

Chao1指數(shù)評估的根內真菌菌群豐富度，初生根和次生根均為C3處理的最小，C1、C2處理與對照處理差異不顯著。Shannon 指數(shù)評估了根內真菌菌群多樣性，生物炭顯著降低了兩類根內真菌多樣性Shannon指數(shù)，初生根內C3處理最小，次生根內C2與C3處理差異不顯著，相對較小。

施用不同比例生物炭條件下初生根和次生根內真菌群落結構變化規(guī)律一致，表現(xiàn)為施用生物炭顯著提高了子囊菌門豐度，顯著降低接合菌門、壺菌門和未鑒定雜菌豐度，對球囊菌門豐度影響不大。初生根內擔子菌門真菌豐度在生物炭用量4.5～9.0 t/hm2處理中顯著降低，在生物炭施用量13.5 t/hm2時顯著升高；次生根內擔子菌門豐度在生物炭用量4.5 t/hm2和13.5 t/hm2處理中顯著降低，在生物炭施用量9.0 t/hm2時顯著升高。在常見目水平，生物炭顯著提高初生根內子囊菌門中巨座殼目和格孢菌目豐度，顯著提高次生根內格孢菌目豐度，同時顯著降低兩類根內子囊菌門中散囊菌目、接合菌門中被孢霉目真菌豐度。在初生根內，在生物炭施用量4.5～9.0 t/hm2時，還顯著提高了肉座菌目和糞殼菌目真菌豐度；在生物炭施用量13.5 t/hm2時，顯著降低了肉座菌目豐度。在次生根內，子囊菌門中巨座殼目豐度在生物炭施用量4.5 t/hm2和13.5 t/hm2處理中均升高，糞殼菌目豐度在生物炭用量4.5～9.0 t/hm2處理中均降低，肉座菌目豐度在生物炭用量9.0～13.5 t/hm2處理中均降低。生物炭對根內真菌影響的研究主要集中在AM真菌，對根內其他真菌研究較少。

冗余分析表明，初生根內子囊菌門內散囊菌目和接合菌門及其被孢霉目真菌豐度與同類根的分支密度和生物量顯著正相關，與其總根長、直徑和比根長顯著負相關。說明上述真菌能促進冬小麥成熟期的初生根分支密度和生物量增長，卻抑制初生根總根長、直徑和比根長增長。本研究中施用生物炭顯著降低小麥成熟期初生根內上述真菌豐度，優(yōu)化初生根形態(tài)，促進了成熟期初生根對養(yǎng)分和水分的吸收利用。次生根內子囊菌門的格孢菌目真菌豐度與生物量顯著正相關，與直徑、分支密度和比根長顯著負相關。說明格孢菌目真菌促進次生根生物量增長，抑制直徑、分支密度和比根長生長。本研究中發(fā)現(xiàn)施用生物炭顯著提高了次生根內格孢菌目真菌豐度，由于此時小麥成熟，次生根組織開始老化，有利于格孢菌目真菌生長繁殖，故此時次生根生物量有增加趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，在生物炭用量13.5 t/hm2時，次生根生物量顯著增加，使光合產(chǎn)物向根系分配的比例增加，卻不利于地上部籽粒灌漿。另外，本試驗中還存在一些不足，試驗僅關注了生物炭對根系內生真菌群落結構的變化影響，忽略了根系內生細菌、根際微生物以及土壤理化性質對根系形態(tài)產(chǎn)生的作用。因此，通過利用根系-內生真菌互利共生，合理施用生物炭，改善土壤環(huán)境，還有待進一步開展田間長期定位研究。

4　結論

(1)生物炭施用量4.5～13.5 t/hm2時，在小麥成熟期顯著降低初生根直徑、分支密度和生物量，顯著增加比根長，總根長變化不明顯；同時顯著降低次生根分支密度。其中生物炭施用量9.0 t/hm2時，顯著降低次生根直徑；施用量13.5 t/hm2時，顯著提高次生根總根長和生物量，顯著降低比根長。

(2)生物炭施用量4.5～13.5 t/hm2時，顯著降低兩類根多樣性Shannon指數(shù)；僅生物炭施用量13.5 t/hm2時，顯著降低兩類根豐富度Chao1指數(shù)。

(3)在門水平上，生物炭施用量4.5～9.0 t/hm2時，顯著提高初生根子囊菌門豐度，顯著降低擔子菌門豐度。生物炭施用量4.5～13.5 t/hm2時，顯著降低兩類根內接合菌門、壺菌門和未鑒定雜菌豐度，球囊菌門豐度變化不明顯。在常見目水平，生物炭施用量4.5～9.0 t/hm2時，顯著提高初生根內子囊菌門中肉座菌目、糞殼菌目、巨座殼目和格孢菌目豐度，顯著降低子囊菌門中散囊菌目和接合菌門內被孢霉目豐度。生物炭施用量4.5～13.5 t/hm2時，顯著提高次生根內子囊菌門中格孢菌目豐度，顯著降低子囊菌門中散囊菌目和接合菌門中被孢霉目豐度。

(4)生物炭施入土壤后，初生根內接合菌門、散囊菌目和被孢霉目真菌豐度對初生根形態(tài)方面的作用最為明顯；次生根內格孢菌目和散囊菌目真菌對次生根形態(tài)的作用最為明顯。

(5)經(jīng)綜合比較，9.0 t/hm2的生物炭處理效果最為明顯，與對照處理相比，小麥成熟期分支密度和生物量分別顯著降低67.26%、27.27%，比根長和初生根直徑顯著提高33.57%、5%；次生根直徑和分支密度分別顯著降低13.16%、34.38%；有效穗數(shù)和產(chǎn)量的增加比例分別為10.60%、28.14%。

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