尖吻蝮蛇凝血酶在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)*

鄧沁，劉宏，蘇薇薇，彭維，吳忠，王永剛，姚宏亮

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510275)

尖吻蝮蛇凝血酶(Haemocoagulase Acutus，簡(jiǎn)寫(xiě)為Halase)是本團(tuán)隊(duì)從尖吻蝮蛇蛇毒中分離純化的一種類凝血酶，研究表明其具有較強(qiáng)的止血作用，且無(wú)毒[1-6]。本文采用125Ⅰ標(biāo)記的放射性同位素法(RA)、三氯醋酸沉淀結(jié)合放射性檢測(cè)法(TCA-RA)研究尖吻蝮蛇凝血酶在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)，為臨床應(yīng)用提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材　料

1.1　試劑與儀器

尖吻蝮蛇凝血酶，實(shí)驗(yàn)室自制，純度大于95%。三氯醋酸，上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站。生理鹽水，中國(guó)大冢制藥有限公司。超純水，用日本密理博公司的純水器制備。微機(jī)多探頭γ-計(jì)數(shù)器：北京核儀器廠，型號(hào)：FJ630G/12。

1.2　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量200 g左右，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院四所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)合格證醫(yī)動(dòng)字第005號(hào)。

2　方法與結(jié)果

2.1　125Ⅰ-Halase的制備

標(biāo)記：采用氯胺T法進(jìn)行尖吻蝮蛇凝血酶的125Ⅰ標(biāo)記。

純化：使用Sephadex G50凝膠柱分離純化125Ⅰ標(biāo)記物，收集125Ⅰ-Halase 測(cè)定放射比活性為52.3 mCi/mg (1 935 MBq/mg)，質(zhì)量濃度為0.84 mCi/mL(31.1 MBq/mL)，放化純度>95%。制備125Ⅰ-Halase色譜圖見(jiàn)圖1。

生物活性：測(cè)定125Ⅰ標(biāo)記后的尖吻蝮蛇凝血酶在標(biāo)準(zhǔn)血漿中的凝血時(shí)間，以檢驗(yàn)標(biāo)記后的Halase生物活性。結(jié)果表明標(biāo)記后不影響樣品的生物活性。HPLC分析也證明標(biāo)記前后色譜行為未改變，見(jiàn)圖2。

圖1　125Ⅰ-Halase色譜圖Fig.1　125Ⅰ-Halase chromatogram

圖2　Halase標(biāo)記前后色譜比較Fig.2　Comparison between labeled Halase and unlabeled HalaseA: 標(biāo)記前的Halase色譜圖; B：標(biāo)記后的Halase色譜圖

2.2　測(cè)定方法的建立和驗(yàn)證

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備以質(zhì)量濃度為0.24 μg/mL的尖吻蝮蛇凝血酶(含放射性6.28 μCi/mL)配置標(biāo)準(zhǔn)液，以生理鹽水為溶劑，配成質(zhì)量濃度為0.03、0.06、0.12、0.30、0.60、1.20、3.00和6.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，各取200 μL標(biāo)準(zhǔn)液置于測(cè)定管中，在γ-計(jì)數(shù)器上測(cè)定1 min，將質(zhì)量濃度與計(jì)數(shù)值(cpm)繪成標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=25.8+5 660.8X(n=8，r=0.999 9)。

2.2.2校正曲線的制備

(1)RA法制備校正曲線：按標(biāo)準(zhǔn)曲線的尖吻蝮蛇凝血酶質(zhì)量濃度和相應(yīng)的125Ⅰ-Halase制備測(cè)定血清中尖吻蝮蛇凝血酶的校正曲線，結(jié)果顯示質(zhì)量濃度與cpm呈直線相關(guān)，校正曲線為：Y=56.3+5 479.8X(n=8，r=0.999 9)。質(zhì)量濃度為0.12、0.60、6.00 ng/mL時(shí)，從血清中用RA法直接測(cè)定尖吻蝮蛇凝血酶的回收率，結(jié)果見(jiàn)表1 ；其日內(nèi)、日間測(cè)定精密度結(jié)果見(jiàn)表2；本法最低能檢測(cè)到0.03 ng /mL。

表1　血清中125Ⅰ-Halase的回收率(Mean±SD， n=5)Table 1　Percent recovery of 125Ⅰ-Halase in serum (Mean±SD， n=5)

表2　血清中125Ⅰ-Halase的測(cè)定精密度(Mean±SD， n=5)Table 2　Precision of 125Ⅰ-Halase in serum (Mean±SD， n=5)

同法制備測(cè)定心、腦、肝、腎、肌肉組織中125Ⅰ-Halase的校正曲線，以及尿、糞、膽汁的校正曲線，結(jié)果分別為：心：Y= 12.5+5 526.0X(n=8，r=0.999 9)；肝：Y= 98.3+5 225.3X(n=8，r=0.999 5)；腎：Y=61.4+5 350.1X(n=8，r=0.999 7)；腦：Y= 13.3+5 542.5X(n=8，r=0.999 7)；肌肉：Y= 68.5+5 338.8X(n=8，r=0.999 9)；尿：Y=219.8+4 915.1X(n=8，r=0.999 5)；糞：Y=138.0+4 882.7X(n=8，r=0.999 9)；膽汁：Y= 17.6+5 653.4X(n=8，r=0.999 9)。

(2)TCA-RA法制備血清校正曲線：按上述血清RA法校正曲線的制作方法，然后每管各加入φ=20%三氯醋酸(TCA)0.2 mL，振蕩，離心(3 000 r/min, 10 min)，棄去上清液，測(cè)定沉淀物中尖吻蝮蛇凝血酶的含量，結(jié)果表明濃度與cpm呈直線相關(guān)，校正曲線為：A=24.7+4 197.7C(n=8，r=0.999 8)。

同法制備測(cè)定心、腦、肝、腎、肌肉三氯醋酸沉淀物中125Ⅰ-Halase的校正曲線，結(jié)果分別為：心：A= 43.5+3 892.3C(n=8，r=0.999 8)；肝：A= 97.2+3 758.2C(n=8，r=0.999 3)；腎：A= 70.8+3 811.1C(n=8，r=0.999 5)； 腦：A= 45.4+3 994.0 C (n=8，r=0.999 3)；肌肉：A= 86.1+3 969.4C(n=8，r=0.999 4)。

2.3　大鼠靜脈給藥三劑量的藥代動(dòng)力學(xué)研究

2.3.1 RA法

(1)總放射性濃度：本試驗(yàn)根據(jù)藥效試驗(yàn)所用劑量，在安全、有效的劑量范圍內(nèi)，設(shè)計(jì)了大鼠靜脈給藥尖吻蝮蛇凝血酶 0.6、1.2和2.4 μg/kg3個(gè)劑量組，每100 g體質(zhì)量給藥體積為0.5 mL，每100 g體質(zhì)量含125Ⅰ-Halase 3.142 μCi。給藥后2、5、15、30 min，1、2、3、4、6、8、12、24、36和48 h 采血，分離出血清，2～30 min各取100 μL血清置于測(cè)定管中，1～48 h各取 200 μL血清置于測(cè)定管中，測(cè)定1 min的放射性。每一時(shí)間點(diǎn)6只大鼠，3 雌 3 雄。三劑量血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間變化趨勢(shì)比較見(jiàn)圖3。

圖3　用RA法測(cè)得的三劑量的血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線比較(Mean±SD， n=6)Fig.3　Comparison of plasma concentration-time curves of three doses using RA method(Mean±SD， n=6)

(2)藥代參數(shù)：將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用中國(guó)藥理學(xué)會(huì)數(shù)學(xué)藥理專業(yè)委員會(huì)的3P97實(shí)用藥代動(dòng)力學(xué)計(jì)算程序自動(dòng)擬合c-t曲線，計(jì)算所得藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表3。用RA法所測(cè)得的iv血清中總放射性的消除半衰期t1/2β8～10 h，AUC與劑量呈正相關(guān)，r為0.999 8。

表3　 由總放射性測(cè)定求得的尖吻蝮蛇凝血酶的藥代參數(shù)

2.3.2TCA-RA法

(1)血清中尖吻蝮蛇凝血酶質(zhì)量濃度：本試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與總放射性測(cè)定方案相同，給藥劑量與采血時(shí)間均同上，采血后取血清200 μL，加等量的φ=20%三氯醋酸，振蕩，3 000 r/min，離心10 min，移走上清液，測(cè)定1 min沉淀物中的放射性。計(jì)算出尖吻蝮蛇凝血酶的質(zhì)量濃度，每一時(shí)間點(diǎn)測(cè)定6只大鼠， 3雌3雄。三劑量血藥濃度-時(shí)間變化趨勢(shì)比較見(jiàn)圖4。結(jié)果可見(jiàn)各時(shí)間點(diǎn)的尖吻蝮蛇凝血酶質(zhì)量濃度與劑量相關(guān)，質(zhì)量濃度比總放射性低，消除也比總放射性快。

圖4　用TCA-RA法測(cè)得的三劑量的血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線比較(Mean±SD， n=6)Fig.4　Comparison of plasma concentration-time curves of three doses using TCA-RA method(Mean±SD， n=6)

(2)藥代參數(shù)：將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用中國(guó)藥理學(xué)會(huì)數(shù)學(xué)藥理專業(yè)委員會(huì)的3P97實(shí)用藥代動(dòng)力學(xué)計(jì)算程序自動(dòng)擬合c-t曲線，計(jì)算所得藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表4。用TCA-RA法所測(cè)得的iv血清沉淀物放射性的消除半衰期t1/2β5～6 h，AUC與劑量呈正相關(guān)，r為0.999 0。

表4　由血清沉淀物含量求得的尖吻蝮蛇凝血酶的藥代參數(shù)Table 4　Pharmacokinetic parameters of Halase calculated by serum sediments

2.4　組織分布試驗(yàn)

2.4.1RA法測(cè)定的總放射性的分布大鼠靜脈注射尖吻蝮蛇凝血酶1.2 μg/kg ( 每100 g體質(zhì)量給藥體積為0.5 mL，每100 g體質(zhì)量含125Ⅰ-Halase 3.142 μCi)，給藥后5 min、30 min、2 h 、8 h和24 h 處死動(dòng)物，取全血、腦、心、肺、肝、脾、腎、胃、小腸、肌肉、脂肪、卵巢、子宮和睪丸，每一組織臟器用水按1∶5的比例制成勻漿，取0.4 mL 進(jìn)行總放射性測(cè)定，再根據(jù)校正曲線計(jì)算出各組織的放射活性含量；每一時(shí)間點(diǎn)取樣6只動(dòng)物，雌雄各半。結(jié)果見(jiàn)圖5，從結(jié)果來(lái)看： 肝、脾和心在給藥后5 min藥物含量最高，其他絕大部分組織在給藥后 30 min藥物含量最高，以后逐漸降低；在各時(shí)間點(diǎn)，放射活性以肝組織含藥量顯著高于其他組織，脾、肺、腎、胃、心等組織含藥量較高，腦、脂肪組織含量最低，除肝臟外各組織含藥量都小于同期的血藥含量。

2.4.2TCA-RA法測(cè)定的尖吻蝮蛇凝血酶分布在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)組織臟器進(jìn)行了尖吻蝮蛇凝血酶原型藥物的測(cè)定。取上述實(shí)驗(yàn)所得組織勻漿400 μL，加TCA 400 μL，振蕩，3 000 r/min離心10 min，移走上清液，沉淀物進(jìn)行放射性測(cè)定。求得組織中尖吻蝮蛇凝血酶含量。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6所列，從結(jié)果來(lái)看： 肝、脾和心在給藥后5 min藥物含量最高，其他絕大部分組織在給藥后 30 min藥物含量最高，以后逐漸降低；在各時(shí)間點(diǎn)，放射活性以肝組織含藥量顯著高于其他組織，脾、肺、腎、胃、心等組織含藥量較高，腦、脂肪組織含量最低。此法與RA法所得結(jié)果一致。

圖5　大鼠靜脈注射1.2 μg/kg尖吻蝮蛇凝血酶后用RA法測(cè)得的組織分布Fig.5　 Tissue distribution detected by RA method in rats injected with 1.2 μg/kg Halase (i.v.)

圖6　大鼠靜脈注射1.2 μg/kg尖吻蝮蛇凝血酶后用TCA-RA法測(cè)得的組織分布Fig.6　 Tissue distribution detected by TCA-RA method in rats injected with 1.2 μg/kg Halase (i.v.)

2.5　排泄試驗(yàn)

2.5.1尿排泄Wistar大鼠，雌雄各4只，靜脈給藥尖吻蝮蛇凝血酶1.2 μg/kg (每100 g體質(zhì)量給藥體積為0.5 mL，每100 g體質(zhì)量含125Ⅰ-Halase 3.142 μCi ) 后放入代謝籠內(nèi)，收集給藥后0～2、2～4、4～6、6～8、8～12、12～24、24～36、36～48、48～72、72～96 h 的尿樣和糞樣，尿樣稀釋并計(jì)量，糞樣用水制成勻漿后計(jì)量。取一定量的尿樣置于測(cè)定管內(nèi)，用γ-計(jì)數(shù)器測(cè)定1 min放射活性，見(jiàn)圖7。從尿累計(jì)排泄量來(lái)看，給藥后96 h內(nèi)由尿排出的放射量約占給藥劑量的73.52%，表明該藥主要是由尿排泄。

2.5.2糞排泄在尿排泄試驗(yàn)收集到的糞樣，制成勻漿后，取一定量的糞樣置于測(cè)定管內(nèi)， 用γ-計(jì)數(shù)器測(cè)定1 min放射活性，結(jié)果見(jiàn)圖8，在 96 h 內(nèi)糞累計(jì)排泄量占所給藥劑量的 12.13%。

2.5.3膽汁排泄Wistar大鼠6只，雌雄兼用，體質(zhì)量200 g左右。烏拉坦(1.2 g/kg，ip)麻醉后，膽管插管，iv 給藥Halase 1.2 μg/kg ，收集給藥后0～2、 2～4、 4～6、6～8、8～12 和12～24 h的膽汁，稀釋后計(jì)量。取0.2 mL膽汁置于測(cè)定管內(nèi)，用γ-計(jì)數(shù)器測(cè)定1 min放射活性，結(jié)果見(jiàn)圖9。給藥后24 h內(nèi)由膽汁排出的藥量占給藥劑量的4.16%。

圖7　大鼠靜脈注射1.2 μg/kg尖吻蝮蛇血酶后尿排泄曲線Fig.7　Urinary excretion cure of rats injected with 1.2 μg/kg Halase (i.v.)

圖8　大鼠靜脈注射1.2 μg/kg尖吻蝮凝血酶后糞排泄曲線Fig.8　Fecal excretion cure of rats injected with 1.2 μg/kg Halase (i.v.)

圖9　大鼠靜脈注射1.2 μg/kg尖吻蝮蛇凝血酶后膽汁排泄曲線Fig.9　Bile excretion cure of rats injected with 1.2 μg/kg Halase (i.v.)

3　討　論

應(yīng)用放射性同位素法進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，測(cè)定原型藥物是放射性同位素法測(cè)定中要解決的關(guān)鍵問(wèn)題，因?yàn)樗幬镞M(jìn)入體內(nèi)后會(huì)被降解，總放射性測(cè)定不能代表原型藥物，為此采用TCA沉淀蛋白法，使尖吻蝮蛇凝血酶沉淀下來(lái)而分解產(chǎn)物及游離125Ⅰ留在上清液中被除去，以使測(cè)定結(jié)果盡可能接近原型尖吻蝮蛇凝血酶的濃度。

從RA法和TCA-RA法研究的尖吻蝮蛇凝血酶組織分布表明，肝、脾和心在給藥后5 min藥物含量最高，其他絕大部分組織在給藥后 30 min藥物含量最高，以后逐漸降低，總放射性與原型藥物在各組織分布的大小順序基本一致。其中在大多數(shù)時(shí)間肝、脾、腎、肺含藥量較高，腦、脂肪含藥量較低。

靜脈注射給藥后96 h內(nèi)，有給藥總量的73.52%由尿中回收，12.13%由糞中回收，這部分可能與分布到胃腸及膽汁排泄有關(guān)，24 h內(nèi)膽汁累積排泄量為4.16%。尿、糞 96 h 的總回收率達(dá)到 85.65%，說(shuō)明尖吻蝮蛇凝血酶的排泄消除去向已較清楚。因此認(rèn)為尖吻蝮蛇凝血酶排泄較完全，并主要由尿排泄。

尖吻蝮蛇凝血酶是一種糖蛋白，與血漿蛋白無(wú)特異性結(jié)合，國(guó)外文獻(xiàn)和新藥申報(bào)均未見(jiàn)有關(guān)蛋白結(jié)合報(bào)告，而且由于其藥效作用(與血漿蛋白的作用)問(wèn)題，會(huì)影響藥物與蛋白的分離，不便進(jìn)行游離藥物的測(cè)定，因此本研究未測(cè)定相關(guān)結(jié)果。

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