微衛(wèi)星不穩(wěn)定性在散發(fā)性結(jié)直腸癌中的研究現(xiàn)狀及展望

李會晨 李梓萱 洪洙

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，在我國其發(fā)病率和死亡率分別位于惡性腫瘤的第3位和第5位，每年新增25萬多病人和約14萬人死于該疾病[1-2]，其中散發(fā)性結(jié)直腸癌(sporadic colorectal cancer，SCRC)約占85%，遺傳性非息肉結(jié)直腸癌 (hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC)約為10%～15%[3]。SCRC主要受環(huán)境、飲食、生活習(xí)慣、慢性炎癥的影響從而引發(fā)“管理員基因”和“門衛(wèi)基因”的突變，使得抑制細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞死亡和維持細(xì)胞穩(wěn)定性的機(jī)制被打亂，其中微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability, MSI)參與了SCRC的發(fā)生，其發(fā)生率為12%～15%[4]。目前的研究表明MSI狀態(tài)與SCRC的預(yù)后以及腫瘤對化療藥物的敏感性相關(guān)，本文將圍繞MSI在SCRC中的研究現(xiàn)狀及其展望進(jìn)行綜述。

一、微衛(wèi)星DNA與MSI

微衛(wèi)星DNA，是由1～6個核苷酸組成的簡單串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，常見的有2、3、4核苷酸重復(fù)序列，尤其以二核苷酸的重復(fù)序列(CA/GT)n最為常見[5]。1981年Miesfeldd等[6]首次發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星DNA, 后發(fā)現(xiàn)其廣泛分布于真核生物的基因組中，約占真核基因組的5%。

MSI是指腫瘤細(xì)胞與正常的組織細(xì)胞相比，由于重復(fù)堿基的缺失或插入而導(dǎo)致的正常微衛(wèi)星長度改變的現(xiàn)象[7]。該現(xiàn)象是錯配修復(fù)基因MLH1、PMS2、MSH2、 MSH6、MLH3、MSH3等變異引起，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞增生及分化異常，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。2001年Fukushima等[8]研究發(fā)現(xiàn)，MSI的發(fā)生顯著提高了基因的隨機(jī)突變率，尤其是導(dǎo)致了腫瘤相關(guān)基因的突變，是引起腫瘤發(fā)生的一個重要機(jī)制。2010年Iacopetta等[9]也發(fā)現(xiàn)MSI能夠?qū)е露喾N抑癌基因如轉(zhuǎn)化生長因子β受體2和編碼BAX蛋白的基因失活，同時(shí)活化一些癌基因如BRAF基因，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生。

二、MSI與SCRC的相關(guān)性

1993年，Thibodeau等[10]首先在HNPCC發(fā)現(xiàn)MSI現(xiàn)象，隨后在各種散發(fā)性腫瘤如胃癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌中均發(fā)現(xiàn)存在MSI。研究表明，結(jié)直腸癌MSI總發(fā)生率在15%～20%，其中SCRC為12%～15%。1997年Kane等[11]通過免疫組織化學(xué)技術(shù)對66例SCRC樣本的研究結(jié)果表明，hMLH1表達(dá)缺失與hMLH1基因啟動子甲基化存在相關(guān)性。2005年董銳增[12]對70例散發(fā)性多原發(fā)大腸癌病人的124個存檔蠟塊和隨訪3年以上的35例散發(fā)性單原發(fā)大腸癌病人的腫瘤組織進(jìn)行MSI測定，發(fā)現(xiàn)散發(fā)性多原發(fā)大腸癌中25.8%的腫瘤表現(xiàn)高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(high-frequency microsatellite instability, MSI-H),單原發(fā)大腸癌為5.7%，其中同時(shí)多原發(fā)大腸癌MSI陽性率為15.6%，異時(shí)多原發(fā)大腸癌為36.7%，MSI可以作為一個重要的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素預(yù)測異時(shí)大腸癌的發(fā)生，亦可作為一個重要指標(biāo)判斷散發(fā)性多原發(fā)大腸癌病人的預(yù)后。2006年Sarli等[13]隨機(jī)選擇108例SCRC病人，對抑癌基因p27的表達(dá)和MSI狀態(tài)之間的相關(guān)性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示59%MSI的SCRC中p27基因表達(dá)發(fā)生改變，而微衛(wèi)星穩(wěn)定的SCRC中改變率僅為24%，推測MSI可能參與了SCRC的發(fā)生。同年Dove-Edwin等[14]研究數(shù)據(jù)顯示HNPCC從小腺瘤到癌的轉(zhuǎn)變僅需3～5年，而大多數(shù)散發(fā)癌則需要20～40年。發(fā)病年齡上，通常散發(fā)性 MSI 結(jié)直腸癌比Lynch綜合征的病人發(fā)病年齡大[12]。2007年Sinicrope等[15]對329例結(jié)直腸癌病人的MSI展開研究，發(fā)現(xiàn)MSI與SCRC的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，而且MSI僅在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，未在與腫瘤相鄰的正常組織及周圍血白細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[15]。

這些研究證實(shí)MSI與SCRC發(fā)生密切相關(guān)， 也有文獻(xiàn)報(bào)道MSI-H的SCRC病人通常伴隨著BRAF-V600E突變。2004年Deng等[16]對26株結(jié)直腸癌細(xì)胞系、80例SCRC以及20例HNPCC樣本的BRAF基因突變和hMLH1基因甲基化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)BRAF基因突變高頻出現(xiàn)在hMLH1甲基化的SCRC中(87%)，而HNPCC中沒有檢測到BRAF基因突變，SCRC的MSI通常伴隨著BRAF基因突變。同年Domingo等[17]檢測206例MSI-H的SCRC樣本和111例HNPCC樣本的BRAF-V600E突變，結(jié)果顯示40% (82/206) MSI-H的 SCRC樣本中檢測到BRAF-V600E突變，而HNPCC中都沒有檢測到，MSI結(jié)合BRAF-V600E與SCRC發(fā)生密切相關(guān)。2010年Hall等[18]發(fā)現(xiàn)BRAF V600E突變僅見于MSI 高的SCRC中。2011年Fearon[19]也發(fā)現(xiàn)MSI-H的SCRC中，很大一部分是由 MLH1啟動子 CpG 島超甲基化所引起，通常與 BRAF-V600E突變有關(guān)。2015年Karahan等[20]研究結(jié)果表明 IHC 標(biāo)記的相關(guān)蛋白與 MSI 腫瘤的病理特征相關(guān)，如 MLH1、PMS2 表達(dá)缺失與病發(fā)于右半結(jié)腸、黏液樣分化差、密集的淋巴細(xì)胞浸潤相關(guān)。錯配修復(fù)(MMR)蛋白表達(dá)缺失可能預(yù)示腫瘤的低度惡性；MSH2 和 MSH6 的表達(dá)缺失率隨著 SCRC 腫瘤體積的增大而增加，其表達(dá)可能參與SCRC腫瘤的進(jìn)展過程；MLH1與MSH2基因的突變始終作用于SCRC 腫瘤的發(fā)展[21]。2016年汪加亮等[22]研究顯示結(jié)直腸癌高頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定與 BRAF 基因突變之間存在密切關(guān)系，并且微衛(wèi)星不穩(wěn)定及 kras基因等與疾病預(yù)后同樣具有密切關(guān)系。2015年Hurtado等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，MSI-H現(xiàn)象和BRAF突變常多見于右半結(jié)腸，推測右半結(jié)腸癌和左半結(jié)腸癌存在不同的分子學(xué)特征， MSI或 BRAF突變的結(jié)腸癌病人發(fā)生腫瘤擴(kuò)散的可能性較小，而存在kras突變者腫瘤擴(kuò)散可能性增加。

三、MSI預(yù)測結(jié)直腸癌病人預(yù)后

多項(xiàng)研究證實(shí)MSI狀態(tài)可預(yù)測結(jié)直腸癌病人預(yù)后。2005年P(guān)opat等[24]對32項(xiàng)研究Meta分析，共計(jì)7 642例Ⅰ～ Ⅳ期的結(jié)直腸癌病人，其中1 277例為MSI-H的結(jié)直腸癌病人，分析結(jié)果顯示MSI-H的結(jié)直腸癌病人的預(yù)后顯著優(yōu)于微衛(wèi)星穩(wěn)定性(microsatellite stable, MSS)的結(jié)直腸癌病人：MSI-H的病人的總生存風(fēng)險(xiǎn)比為0.65(95%置信區(qū)間為0.59～0.71)，MSI-H結(jié)腸癌病人的死亡率比非MSI-H腫瘤病人低35%左右。2012年Roth 等[25]對1 404例年齡在14～76歲 Ⅱ/Ⅲ期結(jié)直腸癌術(shù)后病人追蹤觀察，研究結(jié)果表明與MSS的結(jié)直腸癌相比，MSI-H的結(jié)直腸癌病人預(yù)后更好，無病生存期(disease-free survival,DFS)和總生存期更長(overall survival,OS)。2016年Kim等[26]對2 940例經(jīng)過根治性手術(shù)的Ⅰ～Ⅲ期結(jié)直腸癌病人(其中MSI-H病人261例)臨床觀察發(fā)現(xiàn)，與MSS和低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(low frequency microsatellite instability, MSI-L)病人相比，MSI-H病人具有更好的DFS和OS。

四、MSI與化療藥物的相關(guān)性

化療是結(jié)直腸癌病人術(shù)后一個重要的輔助治療手段，多名學(xué)者就結(jié)直腸癌性和散發(fā)性MSI與化療之間相關(guān)性進(jìn)行研究。2010年Sargent等[27]對457例Ⅱ期、Ⅲ期結(jié)直腸癌病人采用5-Fu為基礎(chǔ)的化療方案治療，發(fā)現(xiàn)具有MMR缺陷的病人并沒有體現(xiàn)出更好的生存率，甚至MMR缺陷的Ⅱ期結(jié)直腸癌病人術(shù)后總體生存率明顯降低。2010年Vilar等[28]研究發(fā)現(xiàn)5-Fu用于 MSI高的Ⅱ期結(jié)直腸癌病人的輔助化療無益，提示可能與病人的錯配修復(fù)缺陷相關(guān)。由于預(yù)后良好且5-Fu輔助化療療效欠佳。2009年Jover等[29]以505例Ⅱ和Ⅲ期術(shù)后結(jié)直腸病人為研究對象，5年隨訪發(fā)現(xiàn)76例MSI-H病人并未從5-Fu輔助化療方案中獲益。2010年Guastadisegni 等[30]MSI狀態(tài)對結(jié)直腸癌病人接受5-Fu化療的臨床意義進(jìn)行了Meta分析，納入31項(xiàng)研究共計(jì)12 782例病人，結(jié)果證實(shí)病人的MSI狀態(tài)均與其DFS和OS相關(guān)。MSS病人可以從5-Fu輔助化療中獲益，而MSI-H的病人的生存結(jié)局尚未顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

五、MSI檢測技術(shù)

目前，臨床中的MSI檢測方法主要有聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法和免疫組織化學(xué)(IHC)法。

1.PCR法 臨床主要采用多重?zé)晒釶CR結(jié)合毛細(xì)管電泳進(jìn)行MSI檢測。MS位點(diǎn)經(jīng)過熒光標(biāo)記的PCR擴(kuò)增后經(jīng)毛細(xì)管電泳進(jìn)行基因組掃描，通過檢測片段長度來判斷MSI狀態(tài)[35]。微衛(wèi)星標(biāo)志物位點(diǎn)一般有BAT-25、BAT-26、MONO-27、NR-21、NR-24單核苷酸位點(diǎn)和D2S123、D5S346、D17S250、PENTA-C、 PENTA-D多核苷酸位點(diǎn)[36]。將腫瘤組織與對應(yīng)的正常組織比較，如果有超過30% 的重復(fù)位點(diǎn)顯示 MSI，則該病人為MSI-H型結(jié)直腸癌病人；如果少于30% 的重復(fù)位點(diǎn)顯示MSI，則該病人為MSI-L型的結(jié)直腸癌病人；如沒有重復(fù)位點(diǎn)顯示MSI，則為MSS型的結(jié)直腸癌病人。如果檢測結(jié)果為MSI-H/L陽性，應(yīng)繼續(xù)檢測BRAFV600E突變情況和MLH1啟動子CpG島超甲基化情況，如BRAF V600E 突變檢測結(jié)果為陽性，診斷為SCRC。如MLH1啟動子CpG島超甲基化檢測結(jié)果為陰性，可結(jié)合生殖系DNA基因檢測證實(shí)為Lynch綜合征相關(guān)的結(jié)直腸癌[37]。

2.IHC法 IHC檢測法是對MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白的表達(dá)情況來判斷MSI狀態(tài)的檢測方法。2011年Stevenson等[35]發(fā)現(xiàn)人類的MMR系統(tǒng)一般優(yōu)先通過hMutSα和hMSH2、hMSH6β形成的異二聚體識別復(fù)制過程中產(chǎn)生的錯誤，然后招募hMutLα啟動DNA修復(fù)過程。如MSH2、MSH6 或PMS2 的檢測結(jié)果異常，則通過生殖系DNA基因檢測證實(shí)為Lynch綜合征相關(guān)的結(jié)直腸癌；如MLH1的檢測結(jié)果異常，則繼續(xù)進(jìn)行BRAF-V600E突變和MLH1啟動子 CpG 島超甲基化檢測，以區(qū)分SCRC和Lynch綜合征相關(guān)的結(jié)直腸癌，若BRAF-V600E 突變或 MLH1 啟動子CpG島超甲基化檢測結(jié)果為陽性，則診斷為SCRC。如 BRAF-V600E 突變和 MLH1 啟動子 CpG 島超甲基化檢測結(jié)果均為陰性，再通過生殖系 DNA 基因檢測證實(shí)為 Lynch 綜合征相關(guān)的結(jié)直腸癌。最常見IHC法檢測結(jié)果是MSH2 和 MSH6染色正常，而MLH1 和PMS2 同時(shí)缺失，表明病人可能是 Lynch 綜合征相關(guān)的結(jié)直腸癌或MMR蛋白缺失的SCRC，需進(jìn)一步檢測 BRAF-V600E 突變和MLH1 啟動子 CpG 島超甲基化來予以區(qū)分[38]。其他少見的MMR蛋白缺失，如 MSH2、MSH6同時(shí)缺失或MSH6、PMS2 的孤立缺失，極有可能是因基因生殖系突變導(dǎo)致的Lynch 綜合征，可對病人的血白細(xì)胞 DNA 或正常組織進(jìn)行生殖系突變分析來予以明確。

對MMR蛋白缺失的結(jié)直腸癌可統(tǒng)稱為MMR缺陷的結(jié)直腸癌，臨床意義上等同于MSI-H的結(jié)直腸癌,而MMR蛋白表達(dá)完整的結(jié)直腸癌則為MSS或MSI -L的結(jié)直腸癌[38]。MSI的PCR法和IHC法檢測均具有高敏感性和特異性。2009年P(guān)alomaki 等[39]經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)PCR 法和 IHC法檢測的一致性>92%。

六、結(jié)語

SCRC的病因和發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，MMR基因變異導(dǎo)致的MSI是其中一個重要因素，多項(xiàng)研究證實(shí)MSI-H的結(jié)直腸癌的篩查在臨床上具有重要意義，不僅可預(yù)測病人的預(yù)后，而且可指導(dǎo)病人的化療治療。盡管如此，在化療用藥方面學(xué)術(shù)上仍存在爭議，這就需要未來更加精細(xì)、更多樣本的臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證。未來MSI 狀態(tài)可能是選擇個體化治療方案的關(guān)鍵指標(biāo)。伴隨著基因檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制將進(jìn)一步被揭開，這將為結(jié)直腸癌的早期診斷、早期預(yù)防以及靶向治療提供基礎(chǔ)，MSI 狀態(tài)也有望成為多種癌癥病人的重要預(yù)后預(yù)測標(biāo)志物[40-42]。

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