CRISPR技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用研究進(jìn)展

梁麗琴 閻婧 張?chǎng)?郝澤婷 段江燕

（山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨汾 041004）

1 CRISPR 概述——從發(fā)現(xiàn)到應(yīng)用過程

CRISPR是細(xì)菌及古細(xì)菌中的一種基于RNA的后天免疫防御系統(tǒng)（Clustered regularly interspersed short palindromic repeats）［1］。CRISPR可利用導(dǎo)向RNA指導(dǎo)Cas蛋白（CRISPR-associated proteins）對(duì)目的基因組進(jìn)行修飾，其結(jié)構(gòu)包括3部分：5'端的反式激活核糖核酸基因，中間部分的Cas蛋白結(jié)構(gòu)基因和3'端的CRISPR基因座，反式激活核糖核酸基因表達(dá)產(chǎn)生的tracrRNA和CRISPR基因表達(dá)產(chǎn)生的crRNA組成二元復(fù)合體，能夠引導(dǎo)Cas蛋白識(shí)別切割目標(biāo)位點(diǎn)［2］。Barrangou等［3］發(fā)現(xiàn)噬菌體入侵后，細(xì)菌利用CRISPR系統(tǒng)整合來自噬菌體的基因組，并改變自身的細(xì)胞表型的抵抗性，用以抵抗入侵的噬菌體，而且這種抵抗特異性取決于整合序列的相似性。2008年，Marraffini等［4］首次通過實(shí)驗(yàn)在葡萄球菌中驗(yàn)證了這種功能。所謂結(jié)構(gòu)決定功能，加州大學(xué)UCB人員報(bào)告了兩種主要的Cas9蛋白子型晶體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而揭示了所有Cas9家庭成員的結(jié)構(gòu)核心［5］，這對(duì)后期理解CRISPR的作用機(jī)理具有重要意義。

到2012年，CRISPR這個(gè)新型基因組定向編輯系統(tǒng)基本成型，并首次登上歷史舞臺(tái)［6-8］，與ZFN、TALEN相比，該系統(tǒng)由導(dǎo)向RNA識(shí)別靶位點(diǎn)，簡單，精確，高效。形象地說，其精確度幾乎與word文檔中的“查找替換”功能相當(dāng)。隨著CRISPR的不斷發(fā)展，現(xiàn)已應(yīng)用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞［7-8］和各種不同的模式生物中，從將其應(yīng)用于小鼠［9-10］、細(xì)菌［11］、真菌［12］、斑馬魚［13］，到實(shí)現(xiàn)在植物中的基因組編輯［14］，如對(duì)西紅柿品種的改良［15］以及編輯棉花耐鹽相關(guān)的內(nèi)源基因［16］，再到對(duì)人類細(xì)胞的基因組編輯［8］，同時(shí)也證實(shí)了該技術(shù)在高等靈長類動(dòng)物中的可應(yīng)用性［17］，近兩年在豬、猴等大型動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)靶向基因編輯并成功構(gòu)建動(dòng)物模型、細(xì)胞模型應(yīng)用于醫(yī)學(xué)。2017年，來自密歇根州立大學(xué)等機(jī)構(gòu)的研究人員首次利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)獼猴胚胎進(jìn)行了編輯［18］。最近，科學(xué)家使用CRISPR技術(shù)編碼細(xì)菌DNA中的信息，這是CRISPR技術(shù)首次被用于向DNA中寫入數(shù)據(jù)［19］?；蚪M編輯技術(shù)CRISPR/Cas9被《科學(xué)》雜志列為2013年年度十大科技進(jìn)展之一，受到人們的高度重視?？梢哉f，短短幾年CRISPR基因編輯技術(shù)迅速席卷了從基礎(chǔ)科學(xué)研究到農(nóng)業(yè)育種及基因治療的各個(gè)領(lǐng)域。

2 CRISPR技術(shù)的改進(jìn)歷程

隨著CRISPR的不斷發(fā)展，該技術(shù)不僅可以編輯基因組中的單個(gè)基因，也可以對(duì)不同的基因位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行編輯。不僅能對(duì)DNA編輯，也首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)RNA的編輯。2016年4月，來自美國加州大學(xué)的研究人員從改變CRISPR/Cas9系統(tǒng)的角度出發(fā)，設(shè)計(jì)了PAMmer短核酸片段與gRNA一起引導(dǎo)Cas9靶向RNA。經(jīng)檢驗(yàn)，該系統(tǒng)成功地靶向編碼蛋白ACTB、TFRC和CCNA2的RNA［20］。這一發(fā)現(xiàn)使得不需要使用人工標(biāo)記就能實(shí)現(xiàn)一段時(shí)間內(nèi)在活細(xì)胞中追蹤RNA，保證了正常的細(xì)胞過程。之后，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了幾種新型的CRISPR酶，它們是CRISPR蛋白-Cas13a突變體，這些酶如果被激活就像“吃豆人”一樣能夠“嚼碎”RNA，因此這些酶類或許能作為診斷傳染性病毒的敏感檢測(cè)器［21-22］。但CRISPR本身在應(yīng)用中顯得不盡完美，科學(xué)家不斷致力于完善CRISPR本身，以提高該技術(shù)的精確性和有效性。

傳統(tǒng)的CRISPR是利用Cas9蛋白對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行切割，2013年首次報(bào)道的基于標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)的CRISPRi（CRISPR interference）能夠精確有效和可逆地抑制基因表達(dá)，它使用的是由兩種蛋白組分形成的融合蛋白：可經(jīng)強(qiáng)力霉素（Doxycycline）誘導(dǎo)而失活的Cas9蛋白（dCas9）和KRAB蛋白的抑制結(jié)構(gòu)域［23］。2016 年，Mandegar等［24］首次利用CRISPRi抑制了人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）基因的表達(dá)：先將編碼dCas9的基因和編碼KRAB抑制結(jié)構(gòu)域的基因融合，形成融合基因dCas9-KRAB的抑制基因，將該融合基因?qū)У讲《据d體上，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞（如iPSCs和源自iPSCs的心肌細(xì)胞）使其表達(dá)，產(chǎn)生的融合蛋白停留在基因組靶位點(diǎn)上并抑制基因表達(dá)而無需切割DNA。盡管CRISPRi暫時(shí)地抑制基因表達(dá)確實(shí)比標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)精確高效，但真正應(yīng)用到基因治療領(lǐng)域則必須考慮病毒載體的可實(shí)施性。2015年9月，CRISPR領(lǐng)頭人之一張鋒發(fā)現(xiàn)了一種迄今為止最為簡單的CRISPR系統(tǒng)——CRISPR/Cpf，酶Cpf1來自弗朗西斯氏菌，具有雙重切割功能：能切割DNA，也能切割RNA。利用Cpf1切割crRNA前體發(fā)夾結(jié)構(gòu)上游從而產(chǎn)生成熟的crRNA，成熟的crRNA引導(dǎo)酶Cpf1特異性地靶向目標(biāo)序列［25］，顯而易見，這個(gè)過程并不需要tracrRNA分子的幫助。因此，CRISPR/Cpf比CRISPR/Cas9更為簡單，比CRISPRi應(yīng)用更廣泛。并且，在2016年6月的一項(xiàng)新研究中，使用Cpf1蛋白家族中編輯效率最高的AsCpf1和LbCpf1開展Degenome-seq測(cè)試結(jié)果表明，CRISPR/Cpf 幾乎沒有脫靶效應(yīng)［26］，這更證明了相比于Cas9，Cpf更優(yōu)越。

2015年11月，Bolukbasi等［27］科學(xué)家將程序化的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域pDBD融入CRISPR/Cas9系統(tǒng)，從而衰減Cas9固有的DNA結(jié)合蛋白親和力，結(jié)果表明，這種可調(diào)控的Cas9-pDBD嵌合體可以提高約100倍的精確性。同年12月，來自美國德州理工大學(xué)健康科學(xué)中心的研究人員通過將雙鏈延伸約5 bp、改變胸腺嘧啶到胞嘧啶或鳥嘌呤的連續(xù)序列的第4個(gè)胸腺嘧啶等方法優(yōu)化sgRNA，使CRISPR基因敲除能力提高50%［28］。也有科學(xué)家通過使用PAM經(jīng)過修飾的金黃色葡萄球菌，測(cè)試擴(kuò)寬靶點(diǎn)范圍后CRISPR的效果，從而改變?cè)摷夹g(shù)的準(zhǔn)確性，而且這種改變PAM的特異性不需要結(jié)構(gòu)信息，因此對(duì)于Cas9 直系同源物具有廣泛的適用性［29］。在一項(xiàng)新的研究中，科學(xué)家將一種脫氨酶引入CRISPR/Cas9系統(tǒng)，這樣引起DNA單個(gè)核苷酸的變化可避免產(chǎn)生有害的雙鏈斷裂［30］。2017年，科學(xué)家默克研發(fā)了一種新型基因組編輯技術(shù)，名為“proxy-CRISPR”，它能夠覆蓋先前無法到達(dá)的基因組區(qū)域，使得CRISPR變得更加高效、靈活和具有特征性［31］。這些研究結(jié)果表明，通過對(duì)PAM、sgRNA、核酶等方面的研究，CRISPR技術(shù)局限性在不斷改進(jìn)和完善。

除此之外，也有科學(xué)家從研究CRISPR的精細(xì)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制出發(fā)來改進(jìn)該系統(tǒng)。美國加州大學(xué)的科學(xué)家利用X射線晶體衍射對(duì)CRISPR/Cas9剪切DNA的過程進(jìn)行了更深入地觀察，在捕獲Cas9蛋白進(jìn)行DNA編輯時(shí)的3D圖像之后，發(fā)現(xiàn)Cas9會(huì)使DNA螺旋發(fā)生彎曲30°，為R環(huán)的形成提供了所需的變形結(jié)構(gòu)。理解CRISPR在作用過程中R環(huán)的形成原因，可以幫助避免對(duì)DNA鏈進(jìn)行錯(cuò)誤剪切［32］。在細(xì)菌中，CRISPR識(shí)別并作用于外源DNA，從而阻止它對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的破壞。而大腸桿菌是如何區(qū)分該細(xì)菌自身和外來遺傳物質(zhì)的，Hayes等［33］科學(xué)家構(gòu)建了大腸桿菌的CRISPR相關(guān)抗病毒防御復(fù)合體識(shí)別病毒遺傳物質(zhì)時(shí)的結(jié)構(gòu)圖，解釋了其作用機(jī)制。以上這些研究對(duì)于提高CRISPR的準(zhǔn)確性、解決CRISPR的靶向錯(cuò)誤以及治療臨床疾病都具有重要意義。

與捕獲外源DNA的CRISPR系統(tǒng)十分類似，研究人員還發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能夠利用RT-Cas1融合蛋白，以一種依賴于RT（逆轉(zhuǎn)錄酶）的方式在體內(nèi)獲得外源RNA，RT-Cas1和Cas2能夠在體外將該 RNA整合到細(xì)菌本身的CRISPR序列中，有望將該系統(tǒng)轉(zhuǎn)入有機(jī)體內(nèi)作為病毒檢測(cè)器使用［34］。此外，加拿大戴爾豪斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院Dellaire博士首次證實(shí)在非分裂細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯確實(shí)是可能的［35］。第一個(gè)CRISPR編輯的有機(jī)體——工程化蘑菇也已經(jīng)開始種植并售賣［36］等，這些研究無疑將CRISPR的發(fā)展推到了一個(gè)新的高度。

盡管CRISPR技術(shù)廣泛應(yīng)用于各大領(lǐng)域，但是它同時(shí)也存在著“脫靶效應(yīng)”這個(gè)科學(xué)家一直以來攻克的難題。2016年初，在CRISPR 共同體會(huì)議上（Creating a CRISPR Community），美國馬薩諸塞州總醫(yī)院和哈佛醫(yī)學(xué)院的Keith Joung等對(duì)Cas9蛋白進(jìn)行了多種改造，最終將其靶向錯(cuò)誤下調(diào)到探測(cè)限制之下。Caribou Biosciences CEO Rachel Haurwitz也報(bào)告了一種由Caribou Biosciences與DuPont Pioneer合作開發(fā)的新型基因組水平無偏技術(shù)，用于探測(cè)CRISPR的靶向錯(cuò)誤，期待該技術(shù)能提高CRISPR的有效性。近日，兩種分析CRISPR/Cas9基因組編輯脫靶效應(yīng)的新方法發(fā)表在了期刊Nature Methods上［37-38］。研究人員發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)CRISPR“關(guān)閉開關(guān)”：AcrllA2和AcrllA4，其中AcrllA4能將脫靶效應(yīng)減少4倍，它們能夠?qū)as9酶發(fā)揮抑制作用，阻礙了它的活性，有效降低了脫靶效應(yīng)［39-40］。此外，Cas9靶向人類細(xì)胞精確性的證實(shí)對(duì)于基因治療和細(xì)胞療法的發(fā)展也有很大的推動(dòng)作用［41］?；诙嘀谼igenome-seq（Digested genome sequencing）的工具，近日被科學(xué)家發(fā)現(xiàn)能同時(shí)繪制高達(dá)11種Cas9核酸酶的全基因組特異性，發(fā)現(xiàn)想要的和不想要的插入和缺失，節(jié)約了時(shí)間，降低了成本［42］。

3 CRISPR技術(shù)在基因治療及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域方面的應(yīng)用

多年來，血液病、腫瘤、遺傳病等疾病一直是醫(yī)學(xué)界的研究難題，而CRISPR無疑推動(dòng)了基因治療攻克這些疾病的進(jìn)程。移植器官的短缺一直是治療器官衰竭的主要障礙，豬是異種供體最理想的動(dòng)物，但內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（一種致癌病毒）的存在卻成了器官移植路上的絆腳石。2015年11月，中國留學(xué)生楊璐菡領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR清除了豬基因組中的這些致癌的病毒基因。他們首先確定了PK15（豬腎上皮細(xì)胞系）逆轉(zhuǎn)錄病毒的拷貝數(shù)是62，然后使用CRISPR滅活了這些病毒基因，并且通過實(shí)驗(yàn)證明消除這些病毒基因?qū)τ谶@種器官移植帶來的傳染性降低至少1 000倍［43］，此項(xiàng)研究掃清了豬器官用于人體移植的重大障礙，大大提高了異種移植在臨床上應(yīng)用上的可能性，因此被稱為 “基因工程的壯舉”。而另一種疾病，由抗肌萎縮蛋白基因的突變?cè)斐傻亩攀霞∪鉅I養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD），也是一個(gè)極具毀滅性的疾病，始終困擾著醫(yī)學(xué)界。2016年，研究者在患杜氏肌肉營養(yǎng)不良癥的小鼠模型中利用CRISPR敲除有缺陷的基因，恢復(fù)了肌營養(yǎng)不良蛋白的表達(dá)，成功治愈杜氏營養(yǎng)不良［44-46］，這標(biāo)志著首次利用CRISPR成功實(shí)現(xiàn)對(duì)遺傳病動(dòng)物出生后的基因治療，給此病的患者帶來了希望。通過直接糾正致病突變，基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9表現(xiàn)出了治療遺傳疾病的重大潛能。研究人員通過研究利用該技術(shù)幫助治療鐮刀形細(xì)胞病和β地中海貧血癥［47］。2017年，科學(xué)家利用CRISPR/Cas9技術(shù)，敲除視細(xì)胞上Nrl與Nr2e3這兩個(gè)基因來幫助患者擺脫失明的陰影［48］。中國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)無論在體外還是體內(nèi)，CRISPR都能抑制HBV的表達(dá)，邁出了利用CRISPR治療HBV的第一步［49］。之后，研究人員發(fā)現(xiàn)利用“基因魔剪”CRISPR/Cas9成功地在活體動(dòng)物基因組中切除HIV-1 DNA片段，完全關(guān)閉了HIV-1的復(fù)制，從而消除HBV引發(fā)的后期感染，這項(xiàng)研究加速了CRISPR治療 HBV 的進(jìn)程［50-51］。

科學(xué)家Paquet等［52］成功利用CRISPR技術(shù)構(gòu)建出細(xì)胞疾病模型，在細(xì)胞中重現(xiàn)了疾病發(fā)生的過程，研究者報(bào)告了一種基于CRISPR的基因組編輯框架，能夠高效精確且有選擇性地引入等位基因序列從而引起改變，并且建立“Correct”這種方式來實(shí)現(xiàn)無痕基因組編輯，該技術(shù)可以高效精確地將致病基因?qū)爰?xì)胞中從而獲取細(xì)胞模型進(jìn)行更深入地研究，為基因療法提供了新視角。

除此之外，杜克大學(xué)的科學(xué)家們利用CRISPR/Cas9技術(shù)將小鼠結(jié)締組織中分離出的細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化成了神經(jīng)元細(xì)胞。他們是利用CRISPR的修改版直接啟動(dòng)已經(jīng)存在于基因組中的天然拷貝。這種方法產(chǎn)生的神經(jīng)元細(xì)胞比以往更完整而持久，有望用于神經(jīng)疾病的建模并開發(fā)新療法［53-54］。2016年8月，美國康奈爾大學(xué)、中南大學(xué)湘雅醫(yī)院等機(jī)構(gòu)的科學(xué)家利用人胚胎干細(xì)胞（Human embryonic stem cells，hESCs）平臺(tái)和高通量藥物/小分子化合物平臺(tái)，與新型基因打靶技術(shù)CRISPR、新一代RNA測(cè)序技術(shù)以及hESCs定向胰島β細(xì)胞分化技術(shù)結(jié)合，在全球首次完成了2型糖尿病易感基因在hESCs定向胰島β細(xì)胞分化過程中的相關(guān)功能驗(yàn)證，并闡述了這些基因在2型糖尿病中的部分機(jī)制［54-55］?？茖W(xué)家們還利用基因編輯技術(shù)改造小鼠干細(xì)胞，使得它們能夠抵抗關(guān)節(jié)炎和其他的慢性疾病導(dǎo)致的炎癥［56］?；贑RISPR/Cas9技術(shù)，科學(xué)家發(fā)明了一種同源非依賴性靶向插入技術(shù)（Homology-independent targeting insertion，HITI），該技術(shù)是一種全新的、可應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床治療的基因編輯方法。這種技術(shù)能夠部分恢復(fù)失明的嚙齒類動(dòng)物的視覺反應(yīng)，為治療多種視網(wǎng)膜疾病、心臟疾病和神經(jīng)疾病等方法打開新的途徑［57］。2016年科學(xué)家利用CRISPR/Cas9編輯小鼠胚胎干細(xì)胞，解釋了一種類型的lncRNA（Long non-coding RNA）與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)相互作用的過程，從而控制心肌細(xì)胞的發(fā)展［58］。2016年8月，美國麻省理工學(xué)院的研究人員首次利用CRISPR/Cas9讓人細(xì)胞變身為記憶存儲(chǔ)系統(tǒng)［59］。2017年2月，西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院的研究人員創(chuàng)建了一種能夠展示從正常血細(xì)胞到白血病一步步進(jìn)展的新模型?？茖W(xué)家們是利用CRISPR技術(shù)將來自骨髓增生異常綜合征和急性髓系白血病患者的血細(xì)胞轉(zhuǎn)變成誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞。這類干細(xì)胞能夠模擬疾病從健康狀態(tài)到白血病的所有階段［54，60］。2017年1月，Salk研究所的科學(xué)家小組利用CRISPR技術(shù)首次成功培育出了人-豬嵌合體胚胎，這是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一個(gè)里程碑［54，61］。同年7月，中國科學(xué)家首次將基因編輯技術(shù)用于干細(xì)胞的遺傳增強(qiáng)，宣布了國際上第一例遺傳增強(qiáng)人類干細(xì)胞（Genetically enhanced stem cells，GES細(xì)胞）的誕生。所謂遺傳指的是這種基因組上的改變?cè)诟杉?xì)胞分裂的過程中，能夠穩(wěn)定地傳遞給子細(xì)胞，而增強(qiáng)指的是經(jīng)過這一微小的遺傳密碼的改變，干細(xì)胞會(huì)“老”的更慢，可以在患者體內(nèi)存活更長時(shí)間，產(chǎn)生更好的再生治療效果［62］。CRISPR作為基因編輯領(lǐng)域的一項(xiàng)新技術(shù)，它對(duì)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的貢獻(xiàn)可以說是百花齊放，碩果累累。

基于CRISPR，癌癥的治療也在不斷取得突破性進(jìn)展。2015年，研究者首次在一個(gè)癌癥動(dòng)物模型中系統(tǒng)地“敲除”了整個(gè)基因組的所有基因，揭示了與腫瘤進(jìn)化和轉(zhuǎn)移相關(guān)的一些基因［63］，可以說，這是利用CRISPR在體內(nèi)鑒別癌癥和其他復(fù)雜疾病相關(guān)基因的重要一步。2016年，科學(xué)家利用CRISPR/Cas9技術(shù)和特殊的DNA條形碼（DNA barcodes）設(shè)計(jì)了一種用于描述和追蹤含感興趣突變的癌細(xì)胞亞群情況的方法。研究人員利用這一技術(shù)模擬了肺癌細(xì)胞抵抗EGFR抑制劑的不同機(jī)制。CRISPR-barcoding可以對(duì)大多數(shù)類型的遺傳修飾進(jìn)行調(diào)查，是一種簡單且高度靈活的方法，有望促進(jìn)對(duì)特定突變的功能研究［64］。2017年，來自匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員利用CRISPR基因編輯技術(shù)有效靶向作用促癌“融合基因”，改善了惡性肝癌和前列腺癌小鼠模型的生存率［65］。科學(xué)家還利用CRISPR基因編輯系統(tǒng)對(duì)小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，小鼠機(jī)體中或許能夠產(chǎn)生和人類機(jī)體腫瘤非常相似的結(jié)腸腫瘤，相關(guān)研究或許能幫助科學(xué)家闡明疾病進(jìn)展的分子機(jī)制以及開發(fā)新型的治療方法［66-67］。

4 CRISPR前景及展望

CRISPR技術(shù)自出現(xiàn)就受到廣泛關(guān)注，已成為新時(shí)代科學(xué)研究領(lǐng)域的有力工具。目前，盡管對(duì)其功能和作用機(jī)理進(jìn)行了諸多研究，以優(yōu)化CRISPR系統(tǒng)從而提高它的有效性和特異性，但是仍然存在一些不足之處，如20 bp的識(shí)別位點(diǎn)的特異性有限，可能造成較高的脫靶效應(yīng)，最終導(dǎo)致嚴(yán)重后果，如引發(fā)癌癥等。且在 Cas9系統(tǒng)中，切割位點(diǎn)必須含有前間區(qū)序列鄰近基序（Protospacer adjacent motif，PAM），限制了對(duì)任意序列的切割。此外，gRNA容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)等等都對(duì)該技術(shù)都有一定的局限性，這些都需要進(jìn)行更深層次地研究。

未來CRISPR 系統(tǒng)研究重點(diǎn)依然在于降低脫靶率，提高其特異性和精確性，可以從優(yōu)化sgRNA結(jié)構(gòu)、脫靶檢測(cè)方法、改造Cas9蛋白或?qū)ふ腋线m的蛋白等方面入手。河北科技大學(xué)的韓春雨團(tuán)隊(duì)在2016年發(fā)現(xiàn)了類似于Cas9的Ago蛋白家族的內(nèi)切酶也能利用寡核苷酸作為向?qū)斫到馊肭值幕蚪M，這種NgAgo-gDNA 系統(tǒng)不像Cas9系統(tǒng)需要PAM序列，結(jié)果表明這種方法無靶向不匹配而且能高效編輯富含G+C的目標(biāo)基因組。同時(shí)，韓春雨指出，Argonaute家族有很多可能做基因編輯的蛋白質(zhì)［68］。這項(xiàng)重大發(fā)現(xiàn)可以說是轟動(dòng)了整個(gè)世界，許多科學(xué)家和學(xué)者對(duì)這一發(fā)明產(chǎn)生了好奇，紛紛在各大實(shí)驗(yàn)室展開重復(fù)實(shí)驗(yàn)。有些實(shí)驗(yàn)室成功復(fù)制了這一實(shí)驗(yàn)，但也有許多科學(xué)家無法成功復(fù)制這一偉大的發(fā)現(xiàn)，于是這項(xiàng)研究一直飽受爭(zhēng)議。近日一個(gè)中國研究團(tuán)隊(duì)發(fā)表了一項(xiàng)關(guān)于NgAgo的新成果，證明了NgAgo-gDNA能夠通過促進(jìn)pgRNA（Peregenomic RNA）的降解有效抑制乙肝病毒的復(fù)制，但他們沒有檢測(cè)到NgAgo有任何DNA編輯的能力［69］。2017年8月2日，因被眾多科學(xué)人員質(zhì)疑，韓春雨團(tuán)隊(duì)主動(dòng)要求撤稿。而韓春雨表示這項(xiàng)技術(shù)的確在自己的實(shí)驗(yàn)室有效，他們將會(huì)繼續(xù)研究這項(xiàng)技術(shù)，調(diào)查重復(fù)率低的原因。這項(xiàng)新技術(shù)無疑為基因編輯技術(shù)的發(fā)明提供了新的研究方向和視角，其發(fā)展還處于初期階段，有關(guān)此方面的問題還需科學(xué)家們進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

其次，CRISPR改造生殖細(xì)胞受到了極大的倫理挑戰(zhàn)。中國廣州中山大學(xué)黃軍課題組［70］用CRISPR首次編輯了人類胚胎基因組，這一事件引起了廣泛的國際爭(zhēng)議，許多科學(xué)家強(qiáng)烈反對(duì)利用CRISPR改造人類生殖細(xì)胞。然而，2016年3月，英國人類生育與胚胎學(xué)管理局宣布正式批準(zhǔn)了倫敦弗朗西斯·克里克研究所研究員Kathy Niakan對(duì)人類胚胎進(jìn)行編輯的請(qǐng)求。

CRISPR/Cas9基因驅(qū)動(dòng)技術(shù)和其改造人類生殖細(xì)胞一樣飽受爭(zhēng)議。如果基因驅(qū)動(dòng)能夠在一定程度上控制一個(gè)物種的繁殖或生存，從理論上說，它就能夠讓該物種滅絕。加上CRISPR操作過程非常簡單易懂，那么，一旦有人濫用，對(duì)人類而言將是危害性的毀滅。因此，對(duì)CRISPR技術(shù)避害揚(yáng)正，讓其更好地為人類服務(wù)，將是基因編輯界在研究過程中需要長期堅(jiān)持的理念。

總之，CRISPR是新時(shí)代科學(xué)研究領(lǐng)域的有力工具，在食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等方面具有十分廣闊的應(yīng)用前景。但CRISPR不僅能進(jìn)行基因組的編輯，而且在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞定位運(yùn)輸功能、新型沉默RNA系統(tǒng)等方面的作用也不斷顯現(xiàn)。此外，人類誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（iPSCs）和CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展從根本上改變了研究者對(duì)生物醫(yī)學(xué)、干細(xì)胞生物學(xué)和人類遺傳學(xué)的研究［71］。如今CRISPR技術(shù)應(yīng)用于功能基因組學(xué)研究、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的構(gòu)建、活細(xì)胞和組織中的基因組成像和譜系追蹤［72］。相信在不久的將來，CRISPR將能夠編輯整個(gè)生物網(wǎng)絡(luò)，幫助人類逐步理解細(xì)胞系統(tǒng)，不斷攻克各種疑難病癥。

致謝：感謝山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院13540301班的全體同學(xué)（成曉輝，崔冰潔，丁晨，郭俊，王學(xué)葉，齊迎迎，何方建，胡亞楠，侯旭峰，金麟雨，劉卓群，盧貴享，聶志華，樸意娜，蘇鵬飛，王彤，趙丹，張玉萍，鄒玉麟）在文獻(xiàn)搜集、整理、翻譯中所做的貢獻(xiàn)。

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