葛根素含量測定方法的研究進(jìn)展

潘麗麗

(貴州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院，貴州 貴陽 551400)

葛根素是從豆科植物葛根中提取的一種異黃酮類化合物，具有降血壓、抗心律失常、降低心肌耗氧量、增加腦血流量、抗血栓、降血糖、降血脂、解酒等作用[1]，且毒性很低。目前葛根素臨床上主要應(yīng)用于治療冠心病、心絞痛、高血壓、糖尿病等疾病[2]。許多葛根及其制劑常選用葛根素的含量作為其質(zhì)量控制指標(biāo)，本文綜述了葛根素含量測定方法的研究進(jìn)展。

1 高效液相色譜法

金麗等[3]采用漢邦Lichrospher C18 柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，甲醇-水(25∶75)為流動相，檢測波長250nm，測定鐵必復(fù)顆粒中葛根素含量，線性范圍為23.84～143.02 μg /mL，平均回收率為97.70%，RSD為0.66%。羅承鋒等[4]測定大鼠血漿中葛根素含量，選用Hypersil ODS C18柱( 4.6 mm×150 mm，5μm)，流動相為甲醇∶水(含50 mmol/ L醋酸銨)=23∶77，熒光檢測器激發(fā)波長250nm，發(fā)射波長480nm，葛根素在0.16～120 mg/ L范圍內(nèi)線性良好，最低檢測限為10 μg/L。湯丹丹等[5]建立同時檢測小鼠血漿、腦勻漿中葛根素的HPLC-MS/MS法，以對羥基苯甲醛為葛根素內(nèi)標(biāo)物，采用Agilent Eclipse plus C18柱(100 mm×4.6 mm，3.5μm)，流動相是甲醇-10 mmol/L乙酸胺(含0.1%甲酸)=80∶20，流速0.6 mL/min，柱溫30 ℃；質(zhì)譜條件：ESI源，霧化溫度為550℃，多反應(yīng)監(jiān)測測定模式，葛根素和對羥基苯甲醛采用負(fù)離子方式(選擇監(jiān)測離子反應(yīng)分別為m/z 415.0→295.0和m/z 120.9→91.8)，該方法分析時間短，僅為4 min。

2 超高效液相色譜法

趙振霞等[6]采用HPLC法和UPLC法兩種方法分別測定心可舒膠囊中葛根素，UPLC 法采用 Acquity T3 C18 (2.1 mm×100 mm，1.8μm) 色譜柱，流動相為乙腈- 0. 1%三氟乙酸水溶液，梯度洗脫，流速為0.5mL/min，檢測波長均為287 nm。葛根素在46.05～1160μg/mL范圍內(nèi)線性良好，平均回收率為100.7%，RSD為1.4%，兩種方法測定心可舒膠囊的葛根素含量一致，但UPLC法梯度洗脫程序較HPLC法簡單，且分析時間、靈敏度等均優(yōu)于HPLC 法。張晨寧等[7]建立超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜法測定降脂活血片中葛根素，采用 Restek Uitra BiPh 色譜柱 ( 100mm×2.1mm，5μm) ，以乙腈 ( 含0.1%甲酸) -0.1%甲酸為流動相，梯度洗脫，流速0.4mL/min，柱溫 40℃，進(jìn)樣量5 μL。質(zhì)譜條件：ESI源，毛細(xì)管電壓3.8 kV，離子源溫度 150 ℃，噴霧氣N2，體積流量 1000 L/h，碰撞氣 Ar，體積流量0.16 mL/min，掃描方式為MRM。葛根素的線性范圍為4.285～1097ng/mL，檢測限為0.7ng/mL，平均回收率為100.2%。

3 分光光度法

梁文法等[8]點樣于硅膠G板上，用氯仿-無水乙醇(7∶3)為展開劑，在紫外燈365nm下定位葛根素，刮下斑點。以乙醇作空白，在251nm處測定吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算葛根中葛根素含量，線性范圍為1～5μg/mL，平均回收率為98.6%。賈貞[9]測定葛根素注射液中葛根素，在358nm波長激發(fā)熒光，在477nm波長處測定葛根素?zé)晒鈴姸取８鸶貪舛仍?. 0×10-7～1. 0×1 0-5mol /L范圍內(nèi)與熒光強度具有良好線性關(guān)系，檢出限為2.02×1 0-8mol /L，與紫外吸收分光光度法結(jié)果相比，令人滿意。趙慧春等[10]將愈風(fēng)寧心片乙醇提取液點于硅膠GF254薄層板，以乙酸乙酯-甲酸-水(48∶6∶6)為展開劑，于紫外燈254nm下觀察斑點位置，刮下斑點，用乙醇浸取，激發(fā)波長258.6 nm，發(fā)射波長477.0 nm，測定相對熒光強度。葛根素檢測限為0.042μg/mL，回收率在93.1%～109.2%，RSD<2%。

4 薄層色譜掃描法

程庚金生等[11]點樣于硅膠GF254板，以氯仿-甲醇-乙酸乙酯-水(3∶3∶4∶1)為展開劑，采用單波長掃描，檢測波長254 nm，狹縫寬度為6mm×0.3mm，測定消渴丸中葛根素含量，在2.0～10.0μg范圍內(nèi)線性良好，平均回收率為101.1%，RSD=1.7 %。李云霞[12]將葛根乙醇提取液點于高效硅膠GF254薄層板，以氯仿-甲醇-水(3∶1∶0.05)第1次展開，再以氯仿-甲醇-水(5∶1∶0.05)第2 次展開，反射法雙波長鋸齒掃描，λs =254nm，λR=333nm。葛根素在0.36 ～3.60μg范圍內(nèi)線性良好，平均回收率為98.72%。孫淑琴等[13]用甲醇超聲提取感冒清熱沖劑中葛根素，以氯仿-甲醇-醋酸乙酯-水(8.1∶9.4∶26∶4)為展開劑，激發(fā)波長為320nm，單波長熒光反射法線性掃描測定，葛根素線性范圍是0.137～0. 685μg，平均加樣回收率為100.40%，RSD 為1.53%。

5 毛細(xì)管電泳法

王烜[14]采用高效毛細(xì)管電泳法測定感冒清熱顆粒中葛根素含量，毛細(xì)管規(guī)格為75 m×64.5cm，分離電壓20kV， 檢測波長254nm，柱溫25℃，采用壓力進(jìn)樣20kPa，進(jìn)樣時間5s。緩沖液是pH值為8.7的25mmol/L磷酸二氫鈉-25mmol/L硼砂溶液。葛根素在0.011～0.11mg/mL性關(guān)系良好，檢測限較低，為0.57μg/mL，加樣回收率99.69%。黃麗涵等[15]采用膠束電動色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定心腦康膠囊中的葛根素，石英毛細(xì)管(80cm×50μm)為分離通道，以30mmol/L月桂酸-90mmol /L氨水(pH值9.0)為緩沖溶液，50%異丙醇(含1mmol/L乙酸)為鞘液，鞘液流速 8μL/min。質(zhì)譜條件：電噴霧電離源，采用選擇性離子監(jiān)測，毛細(xì)管電壓為4.3 kV，噴霧氣壓力為34.3 kPa，干燥氣10L/min，溫度為325℃。葛根素的線性范圍為0.50 ～500mg/L，檢出限為0.050mg /L，回收率為96.5%，RSD為3.1%。

6 近紅外光譜法

石猛等[16]采集消渴丸干模丸的近紅外光譜，與HPLC檢測結(jié)果關(guān)聯(lián)進(jìn)行化學(xué)計量學(xué)分析，結(jié)合偏最小二乘法建立干模丸中葛根素含量的定量校正模型：R2=0.9482，RMSECV=0.248，RPD=4.40。對驗證集樣品預(yù)測平均相對偏差為3.51%，模型預(yù)測性能良好。王寧等[17]建立一種快速測定心通口服液中葛根素含量的新方法，采用聲光可調(diào)濾光器-近紅外光譜分析技術(shù)，建立葛根素近紅外光譜與HPLC分析值之間的數(shù)學(xué)模型。建立的定量模型準(zhǔn)確性好，葛根素的內(nèi)部交叉驗證均方差是RMSEP=0.1371，R2=0. 9845。

7 酶聯(lián)免疫吸附測定法

單文超等[18]建立間接競爭酶聯(lián)免疫分析法測定葛根中葛根素的含量，線性范圍為15.6～500ng/mL，孔間差和板間差均不大于3.5%，平均回收率為 101.8%，并且該法檢測結(jié)果與HPLC法檢測結(jié)果一致。萬鳳[19]采用ELISA法測定人唾液中葛根素含量，葛根素的線性范圍為5～1280 ng/mL，r=0.9939，最低檢測限為2.47 ng/mL，平均回收率為95%～115%，與HPLC法測定結(jié)果的相關(guān)性良好。宋興興等[20]利用ELISA原理研制出一種簡便、快速評價葛根藥材質(zhì)量的膠體金試紙，葛根素膠體金試紙的半定量限為34g /mL，適用于原料采購現(xiàn)場的快速檢測。

葛根素的測定方法很多，各具特點。高效液相色譜法是測定葛根素含量的常用方法，具有重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點，但耗時、成本較高。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是一種分離分析復(fù)雜有機混合物的有效手段，靈敏度高、選擇性好，但儀器較昂貴，其應(yīng)用還不夠普遍。超高效液相色譜法與傳統(tǒng)的HPLC相比，增加了分析的通量和靈敏度，能快速分離樣品，同時節(jié)省流動相，降低分析成本。近紅外光譜法具有分析速度快、對樣品無破壞性、無污染、操作簡便、結(jié)果精準(zhǔn)等優(yōu)點，可實現(xiàn)葛根素的快速分析和在線檢測。酶聯(lián)免疫吸附測定法具有特異性強，靈敏度高，儀器化程度低，經(jīng)濟(jì)無污染等特點，特別適用于分析微量基質(zhì)生物樣品中葛根素含量。筆者認(rèn)為，隨著含葛根素藥物的指紋圖譜和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的不斷發(fā)展，通過多種分析方法的聯(lián)用，能尋求到簡便快速、準(zhǔn)確高效的測定方法，為葛根素的質(zhì)量控制提供更可靠的依據(jù)。