宏基因組學(xué)在傳染病防控中的應(yīng)用進(jìn)展

李沛翰 李鵬 宋宏彬

（解放軍疾病預(yù)防控制所，北京 100071）

近年來(lái)，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（Sever acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome-related coronavirus，MERS-CoV）、埃博拉病毒（Ebola virus）、甲型流感病毒H7N9亞型（Influenza A virus subtype H7N9）等新發(fā)突發(fā)病原體造成的傳染病疫情給公共衛(wèi)生防控帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。2002年國(guó)內(nèi)暴發(fā)了嚴(yán)重急性呼吸道感染疫情，初期病原體難以確定給疫情防控帶來(lái)極大困難。直至2003年4月，研究人員明確病原為SARS冠狀病毒，并制定針對(duì)性的診斷方法和預(yù)防措施，疫情才得到有效控制。此次疫情先后蔓延至37個(gè)國(guó)家，共導(dǎo)致約8 000人感染和774例死亡，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)恐慌［1-2］。因此在應(yīng)對(duì)公共衛(wèi)生突發(fā)事件，尤其是新發(fā)突發(fā)傳染病時(shí)，快速準(zhǔn)確識(shí)別致病病原對(duì)制定疫情防控策略至關(guān)重要。

傳統(tǒng)病原檢測(cè)以分離培養(yǎng)、顯微鏡觀察、血清學(xué)診斷及PCR等方法為主，存在諸多問(wèn)題。分離培養(yǎng)方法適用于少數(shù)可培養(yǎng)微生物，但目前僅不足1%的細(xì)菌可以通過(guò)這種方式進(jìn)行鑒定［3］；顯微鏡觀察從形態(tài)學(xué)上進(jìn)行鑒定，但靈敏度較低［4］；血清學(xué)診斷容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，特異性差［5］；PCR方法無(wú)法檢測(cè)未知病原和變異較大病原［6］?；趥鹘y(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，目前高達(dá)40%的腸胃炎和60%的腦炎臨床病例無(wú)法有效確定致病病原［7-8］。

20世紀(jì)90年代，Handelsman等［9］首次提出了宏基因組（Metagenome）的概念，其泛指環(huán)境樣本中所有微生物基因組的總和。隨后宏基因組學(xué)（Metagenomics）被定義為將現(xiàn)代基因組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于直接研究自然狀態(tài)下的微生物群落，避免在實(shí)驗(yàn)室單獨(dú)分離微生物的科學(xué)［10］。宏基因組學(xué)研究廣泛應(yīng)用于土壤、水體等環(huán)境樣本，以及與人類疾病相關(guān)的微生物群落的生物多樣性分析。此外，由于宏基因組學(xué)無(wú)需單獨(dú)對(duì)病原分離培養(yǎng)，通過(guò)核酸提取純化可以直接分析臨床樣本，其為傳染病病原尤其是未知病原檢測(cè)提供了新的技術(shù)手段和思路［11］。

本文對(duì)宏基因組學(xué)的技術(shù)進(jìn)展及其在病原監(jiān)測(cè)、檢測(cè)和溯源等公共衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，旨在為傳染病預(yù)防和控制提供參考和新視角。

1 宏基因組技術(shù)進(jìn)展

宏基因組學(xué)以樣本中所有核酸為研究對(duì)象，隨著各類技術(shù)的不斷發(fā)展，宏基因組學(xué)逐步走向成熟，并且在核酸提取、高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)分析等方面均有較大發(fā)展空間。

1.1 核酸提取

臨床樣本包含多種微生物，且非核酸雜質(zhì)多，核酸提取的效率和純度相對(duì)較低，核酸提取是宏基因組研究的關(guān)鍵步驟。根據(jù)研究目的和樣本差異，選擇合適的提取方法得到高質(zhì)量核酸有利于后續(xù)病原的鑒定分析。

細(xì)菌結(jié)構(gòu)差異會(huì)給測(cè)序結(jié)果帶來(lái)較大影響。研究表明使用研磨珠裂解法比酶裂解法獲得更多雙歧桿菌核酸，并導(dǎo)致結(jié)果中梭菌屬和放線菌群組成差異［12］。20世紀(jì)90年代的幾項(xiàng)研究表明細(xì)菌的16S rDNA序列是病原體發(fā)現(xiàn)和鑒定的重要依據(jù)［13-14］，早期的宏基因組學(xué)以16S rDNA測(cè)序?yàn)橹?，常用?lái)分析樣本中菌群分布特征。16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序采用通用引物擴(kuò)增，引物選擇至關(guān)重要。Marchesi等［15］對(duì)兩種引物進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，63f-1387r引物能比27f-1392r擴(kuò)增得到更多的物種。通過(guò)測(cè)試175個(gè)引物和512個(gè)引物對(duì)，Klindworth等［16］發(fā)現(xiàn)僅有10個(gè)引物能擴(kuò)增較多種微生物，但這些引物對(duì)古細(xì)菌擴(kuò)增效果差，仍需進(jìn)行額外引物設(shè)計(jì)。高變區(qū)（V區(qū)）的選擇策略不同也會(huì)造成結(jié)果差異。Claesson等［17］發(fā)現(xiàn)V6區(qū)域可變性高，有利于分析物種多樣性，但V4區(qū)域比V6區(qū)域獲得更高準(zhǔn)確度。

相比原核和真核生物，病毒基因組較短，其在臨床感染樣本中豐度較低，且與多種其它類型生物核酸混雜，如何排除干擾提取濃度較高的病毒核酸對(duì)于宏基因組研究至關(guān)重要。Thurber等［18］提出了使用SYBR-Gold試劑染色，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)處理樣品中病毒顆粒的數(shù)量，濃縮來(lái)自各種類型樣品的病毒顆粒，消除污染細(xì)胞和游離核酸。此外，對(duì)于研究某一生態(tài)群落的病毒，可使用隨機(jī)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，其關(guān)鍵點(diǎn)在于需要針對(duì)某一病毒群體如呼吸道病毒、腸道病毒等設(shè)計(jì)通用引物。對(duì)于DNA病毒核酸富集提取采用CTAB法、氯仿抽提法等，前者使用十六烷基三甲基溴化銨（Cetyl-trimethylammonium bromide，CTAB）溶液提取，并通過(guò)“三合一”溶液（酚:氯仿:異戊醇=25∶24∶1）等步驟實(shí)現(xiàn)病毒DNA的提純［19］；后者則采用十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfonate，SDS）和苯酚-氯仿萃取，最終實(shí)現(xiàn)樣本DNA病毒的提?。?0］。RNA病毒核酸提取常采用Trizol 法，該方法使用異硫氰酸胍、苯酚和氯仿形成三相溶液，進(jìn)一步通過(guò)分離中間相和有機(jī)相中的DNA和蛋白質(zhì)，然后可沉淀得到水相中的病毒RNA［21］。此外，大量商業(yè)化試劑盒和自動(dòng)化制備儀器的出現(xiàn)，使病毒核酸提取更加方便快捷，如專門純化提取RNA病毒的試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit，以及自動(dòng)化核酸提取工作站Qiagen BioRobot 9604 等［22］。

1.2 高通量測(cè)序

受限于測(cè)序技術(shù)，16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序早期使用Sanger法，隨后出現(xiàn)基于焦磷酸測(cè)序方法的商業(yè)化測(cè)序平臺(tái)454，其通量比傳統(tǒng)Sanger法高，在16S rDNA高變區(qū)測(cè)序和病原鑒定中具有廣泛的應(yīng)用［23］。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，Illumina與Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)作為第二代測(cè)序平臺(tái)主導(dǎo)，與454相比其成本大幅下降，在宏基因組測(cè)序中展示出巨大潛力。研究顯示Ion Torrent PGM測(cè)序速度比Illumina MiSeq更高，且能比MiSeq獲得更高的讀長(zhǎng)，但是MiSeq的覆蓋度較高［24］。

二代測(cè)序需要對(duì)樣本進(jìn)行建庫(kù)及擴(kuò)增，初始樣本中的物種豐度差異導(dǎo)致擴(kuò)增后出現(xiàn)高豐度物種覆蓋過(guò)高和低豐度物種覆蓋不足的情況。臨床樣本包含多種復(fù)雜微生物，數(shù)據(jù)分析受到讀長(zhǎng)限制，較長(zhǎng)讀長(zhǎng)能夠使組裝更加準(zhǔn)確。PacBio等三代測(cè)序平臺(tái)采用單分子測(cè)序技術(shù)，無(wú)需擴(kuò)增DNA分子即可測(cè)得基因序列，并且讀長(zhǎng)更長(zhǎng)，有效彌補(bǔ)了二代測(cè)序的局限性。PacBio對(duì)16S rDNA的準(zhǔn)確度和覆蓋度都較低［25］，但通過(guò)改進(jìn)可直接測(cè)得16S rDNA全長(zhǎng)，準(zhǔn)確度可由之前的80%提高到99%［26］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)分析內(nèi)容包括擴(kuò)增子測(cè)序分析以及全基因組測(cè)序分析。擴(kuò)增子測(cè)序首先生成操作性分類單位（Operational taxonomic unit，OTU），之后進(jìn)行物種群落和多樣性分析，包括Alpha多樣性、Beta 多樣性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析等［27］。全基因組測(cè)序產(chǎn)生海量數(shù)據(jù)，涉及大量不同物種，數(shù)據(jù)分析難度大，主要包括數(shù)據(jù)的拼接組裝、基因預(yù)測(cè)、功能注釋等［28］?；蚪M裝（Genome assembly）將測(cè)序得到的堿基片段經(jīng)過(guò)拼接和組裝得到較長(zhǎng)片段堿基序列，目前針對(duì)第二代測(cè)序技術(shù)，主流算法是基于圖論的de Bruijn Graph（DBG）算法［29］；基因預(yù)測(cè)一般用于預(yù)測(cè) DNA 序列中編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的部分，即預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)基因，目前有基于序列相似性和基于統(tǒng)計(jì)學(xué)模型的兩種預(yù)測(cè)方法［30］；在進(jìn)行基因預(yù)測(cè)之后，將基因或蛋白序列在特定的數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索比對(duì)，從而完成功能注釋分析。

目前已有專門用于宏基因組分析的流程化軟件和工具，如 QIIME［31］、MEGAN［32］等，但分析計(jì)算量巨大，通常依賴于大型高性能計(jì)算平臺(tái)，可以部署在高性能計(jì)算機(jī)上，并可在完成拼接、比對(duì)等高計(jì)算要求后，將結(jié)果傳輸?shù)絺€(gè)人電腦進(jìn)行后續(xù)進(jìn)化、聚類、生物多樣性等分析。也可以利用宏基因組云計(jì)算平臺(tái)，如 IMG-M（http://img.jgi.doe.gov/m）［33］，Galaxy（http://g2.bx.psu.edu）［34］和 MG-RAST（http://metagenomics.anl.gov/）［35］等進(jìn)行常規(guī)宏基因組分析，通過(guò)在線儲(chǔ)存、定位進(jìn)行數(shù)據(jù)共享，使海量資源得到充分利用。宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)中包含多類物種，通過(guò)算法優(yōu)化來(lái)解決海量數(shù)據(jù)快速分析問(wèn)題，如Li等［36］開發(fā)的針對(duì)宏基因組大數(shù)據(jù)量的快速聚類算法，這類生物信息學(xué)分析工具極大促進(jìn)了宏基因組的發(fā)展。

2 宏基因組在傳染病防控中的應(yīng)用

基于高通量測(cè)序的宏基因組學(xué)可以得到樣本中全部物種的基因組，從而能同時(shí)識(shí)別所有致病病原體，極大減少逐個(gè)排除可疑病原所耗費(fèi)的時(shí)間及人力物力，并可對(duì)未知病原或已知變異較大病原進(jìn)行識(shí)別，為傳染病防控帶來(lái)新的思路。目前，宏基因組在公共衛(wèi)生監(jiān)測(cè)、病原檢測(cè)以及傳染病溯源等方面得到了廣泛應(yīng)用。

2.1 病原監(jiān)測(cè)

采集某一地區(qū)或人群的臨床樣本、食品和媒介生物等各類樣本進(jìn)行宏基因組學(xué)測(cè)序，監(jiān)測(cè)潛在致病病原，對(duì)可能出現(xiàn)的疫情進(jìn)行預(yù)測(cè)預(yù)警，可有效預(yù)防突發(fā)公共衛(wèi)生事件發(fā)生。

宏基因組能夠克服傳統(tǒng)方法的局限性，實(shí)現(xiàn)病原的高精度識(shí)別，為日常病原監(jiān)測(cè)提供指導(dǎo)。Fischer等［37］收集了24例季節(jié)性流感患者支氣管肺泡灌洗液、痰液和咽拭子樣本，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示H3N2和H1N1呈陽(yáng)性，但不能進(jìn)一步分型，通過(guò)宏基因組測(cè)序并與已報(bào)道的基因組比對(duì)，能精確其具體型別，而且在部分樣本中發(fā)現(xiàn)其它病毒或細(xì)菌的混合感染。此外，對(duì)特定癥候人群進(jìn)行病原監(jiān)測(cè)，能預(yù)測(cè)傳染病暴發(fā)，并對(duì)出現(xiàn)相似癥狀的患者預(yù)警。研究者使用波多黎各、剛果、加利福尼亞等地區(qū)急性發(fā)熱病人的血液樣本，未分離培養(yǎng)直接提取核酸后進(jìn)行測(cè)序，分別檢測(cè)到基孔肯雅病毒，埃博拉病毒和丙型肝炎病毒，并且使用PCR驗(yàn)證結(jié)果［38］。一項(xiàng)研究使用宏基因組監(jiān)測(cè)呼吸道疾病，采集210例患者鼻咽抽吸樣本，提取核酸后分別進(jìn)行DNA和RNA建庫(kù)測(cè)序，在樣本中檢測(cè)到副黏病毒科、正黏病毒科和小RNA病毒科等多種病毒，發(fā)現(xiàn)一種新型鼻病毒，收集這些臨床樣本信息能建立預(yù)警機(jī)制，在出現(xiàn)異常時(shí)能快速判斷可能造成疫情的病原微生物，防止新突發(fā)傳染病的發(fā)生［39］。

隨著全球化貿(mào)易的發(fā)展，病原借助于食品進(jìn)行傳播的風(fēng)險(xiǎn)加大，食品監(jiān)測(cè)日益重要，但受限于檢測(cè)范圍，不能完全排除食物攜帶病原的可能性。Temmam等［40］通過(guò)對(duì)進(jìn)口動(dòng)物肉制品進(jìn)行宏基因組測(cè)序，檢測(cè)到冠狀病毒、黃病毒、痘病毒、漢坦病毒等可能感染人類的病毒，表明其可能存在致病風(fēng)險(xiǎn)。Ng等［41］對(duì)墨西哥灣捕獲的12只健康北方粉紅蝦進(jìn)行宏基因組檢測(cè)，在樣本中發(fā)現(xiàn)了諾達(dá)病毒和一種新型的環(huán)狀單鏈DNA病毒，需要對(duì)食品可能造成的病原傳播提高警惕。宏基因組對(duì)食品的病原監(jiān)測(cè)有助于阻止病原體從境外流入和擴(kuò)散，預(yù)防食源性傳染病的發(fā)生。

相同策略的宏基因組研究方法也可監(jiān)測(cè)媒介生物，評(píng)估病原體感染人類的可能性，預(yù)防人畜共患病發(fā)生。為評(píng)估野生老鼠攜帶病毒對(duì)人類的致病風(fēng)險(xiǎn)，研究者采集了德國(guó)柏林地區(qū)20只野生老鼠的腸道提取物樣本并進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)到博卡病毒、沙波病毒、諾瓦克病毒和輪狀病毒等多種病原，其中的輪狀病毒株與人類致病密切相關(guān)［42］。Coffey等［43］對(duì)澳大利亞蚊子進(jìn)行研究，分別提取其DNA和RNA進(jìn)行深度測(cè)序，檢測(cè)到羅斯河病毒、黃病毒、環(huán)狀病毒等多種潛在致病微生物，這對(duì)于預(yù)防蟲媒傳染病，防止其大規(guī)模暴發(fā)具有重要意義。

2.2 病原檢測(cè)

不明原因疾病和未知病原增加了臨床診斷難度，無(wú)法進(jìn)行有效治療，導(dǎo)致患者病情加重甚至死亡。通過(guò)測(cè)序樣本，并結(jié)合傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室診斷方法進(jìn)行驗(yàn)證，宏基因組學(xué)在病原檢測(cè)中發(fā)揮日益重要的作用。

宏基因組檢測(cè)能夠得到病原全部基因信息，在更深入的層次上探究病原感染原因。研究顯示，埃博拉病毒治愈后，病毒抗體可在體內(nèi)持續(xù)至少10年，復(fù)發(fā)幾率極低［44］。一名埃博拉患者治愈出院9個(gè)月之后出現(xiàn)復(fù)發(fā)癥狀，用PCR檢測(cè)到了埃博拉病毒，但是不能確定是原病毒還是新變異病毒的感染。為了研究再次感染的原因，研究者采取病人腦脊液和血清進(jìn)行宏基因組測(cè)序，檢測(cè)到的序列與初次發(fā)病的序列僅有兩個(gè)非編碼區(qū)的變化，調(diào)整治療方案后患者病情好轉(zhuǎn)［45］。這項(xiàng)研究重新說(shuō)明了埃博拉病毒具有復(fù)發(fā)的可能性，不能停止對(duì)埃博拉康復(fù)患者的檢測(cè)，這對(duì)于疫情治療和控制具有重要作用。

2011年德國(guó)暴發(fā)了急性腸出血性流行病，疫情初期沒(méi)有特異性手段檢測(cè)病原感染，而分離培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)且比較困難。在對(duì)此次疫情進(jìn)行回顧性研究中，Loman等［46］采用宏基因組檢測(cè)方法，采取40例疫情暴發(fā)期間的產(chǎn)志賀毒素型大腸桿菌（STEC）陽(yáng)性糞便樣本，并使用5例STEC陰性腹瀉樣本作為對(duì)照，未經(jīng)分離培養(yǎng)直接提取DNA進(jìn)行測(cè)序。于STEC陽(yáng)性患者的樣本中檢測(cè)到該疾病的致病菌株STEC O104∶H4，并且進(jìn)一步檢測(cè)到產(chǎn)志賀毒素的基因片段，在5例對(duì)照組中也檢測(cè)到了艱難梭菌、空腸彎曲桿菌和沙門氏菌的感染。表明了宏基因組使用非培養(yǎng)樣本檢測(cè)病原體并分析其毒力的潛力。

2007-2010年河南暴發(fā)了發(fā)熱伴血小板減少綜合征（Fever，thrombocyte-penia and leukopenia syndrome，F(xiàn)TLS）疫情，初始使用反轉(zhuǎn)錄PCR、PCR和免疫熒光血清學(xué)分析檢測(cè)了黃病毒科、日本腦炎病毒、披膜病毒科等可能微生物，均未能確定致病病原。Xu等［47］收集了285例患者的急性期血清樣本，之后將未分離培養(yǎng)的樣本直接進(jìn)行宏基因組測(cè)序，檢測(cè)到了一種新型病毒序列，通過(guò)比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)其與已知布尼亞病毒科具有遺傳相似性，是布尼亞病毒科白蛉病毒屬的新成員。隨后根據(jù)測(cè)得的基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，以及使用免疫熒光血清學(xué)分析，結(jié)果均呈陽(yáng)性，并對(duì)患者血清進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，成功分離出此病毒，最終確定了導(dǎo)致此次疫情的就是新型布尼亞病毒。

德國(guó)一名患者出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）的癥狀，使用PCR和分離培養(yǎng)方法檢測(cè)流感病毒、腺病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體等多種病原均為陰性，使用抗生素治療無(wú)效，患者在6日后死亡。當(dāng)?shù)诙嗤Y狀患者出現(xiàn)時(shí)，F(xiàn)isher等［48］使用宏基因組方法，采集患者的支氣管肺泡灌洗樣本，提取核酸后進(jìn)行二代測(cè)序，在50 h內(nèi)快速確定了致病病原是鸚鵡熱衣原體，隨后根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，使用PCR驗(yàn)證了檢測(cè)結(jié)果，并對(duì)患者進(jìn)行針對(duì)性的抗生素治療，患者病情減輕。第三例患者曾與第二例患者進(jìn)行接觸，并出現(xiàn)同樣癥狀，推測(cè)是第二例患者導(dǎo)致的感染，采用前述抗生素治療后患者迅速好轉(zhuǎn)。宏基因組對(duì)不明原因疾病患者的診斷，有助于及時(shí)求治患者，并為后續(xù)患者的診斷治療提供指導(dǎo)。

病毒、細(xì)菌和真菌等多種病原微生物均可引起腦膜炎，逐一排查可疑病原體費(fèi)時(shí)費(fèi)力。北京協(xié)和醫(yī)院4例患者臨床診斷為疑似病毒性腦膜炎，通過(guò)測(cè)序2例患者腦脊液樣本，檢測(cè)到單純皰疹病毒1型（HSV-1），另外兩名患者樣本中檢測(cè)到單純皰疹病毒2型（HSV-2）和人類皰疹病毒3型（HHV-3），并隨后通過(guò)PCR對(duì)其中3例進(jìn)行確認(rèn)［49］。2014年北京3例腦膜炎患者被診斷為疑似李斯特菌感染，但對(duì)樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)結(jié)果為陰性，研究者對(duì)患者的腦脊液進(jìn)行了直接測(cè)序，檢測(cè)到李斯特菌序列，并利用PCR進(jìn)一步驗(yàn)證，確認(rèn)是李斯特菌引起的感染［50］。以上研究表明宏基因組具有檢測(cè)罕見病原感染的能力，基于測(cè)序的快速診斷對(duì)于應(yīng)對(duì)未知原因且致命的腦膜炎感染至關(guān)重要。

器官移植患者容易發(fā)生異常感染，宏基因組方法能夠確定感染患者的致病病原。一名2歲男孩在干細(xì)胞移植后出現(xiàn)高燒，紅疹和全身皮膚變黑等癥狀，使用分離培養(yǎng)和PCR檢測(cè)可疑病原均為陰性，常規(guī)抗生素治療均無(wú)效，Ye等［51］對(duì)患者血液樣本進(jìn)行二代測(cè)序，檢測(cè)出痤瘡丙酸桿菌感染，并在臨床治療上調(diào)整抗生素治療方法，患者迅速好轉(zhuǎn)。三名患者接受同一位捐贈(zèng)者的肝移植或腎移植，捐贈(zèng)者之后因腦出血死亡，三名接受者也先后因腦病死亡，推測(cè)可能由病原感染造成。使用分離培養(yǎng)和PCR方法檢測(cè)皰疹病毒、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、弓形蟲、結(jié)核桿菌等病原體，均未檢測(cè)到致病病原。Palacios等［52］采取捐贈(zèng)者和接收者腦脊液、血液、腎臟、肝臟等樣本，提取RNA進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)到一種新型沙粒病毒，隨后設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR、分離培養(yǎng)和血清學(xué)檢測(cè)，均證實(shí)了結(jié)果。此外，一例12歲患者在腎臟移植后出現(xiàn)發(fā)燒、畏寒、身體疼痛等癥狀，使用PCR和血清學(xué)檢測(cè)一系列病原均為陰性，研究者通過(guò)對(duì)腦脊液樣本進(jìn)行宏基因組測(cè)序，檢測(cè)到了西尼羅病毒的序列，在進(jìn)行針對(duì)性治療后患者迅速好轉(zhuǎn)，并在恢復(fù)期檢測(cè)到西尼羅病毒抗體，證實(shí)了西尼羅病毒的感染［53］。值得關(guān)注的是，在病人急性期使用血清學(xué)檢測(cè)西尼羅病毒，可能由于免疫抑制作用，結(jié)果呈現(xiàn)假陰性，并且由于腦脊液中西尼羅病毒的反轉(zhuǎn)錄PCR敏感性較差，未使用反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)西尼羅病毒。宏基因組方法在此情況下發(fā)揮作用，說(shuō)明其具有較強(qiáng)的病原檢測(cè)能力。

此外，許多新型病原可導(dǎo)致臨床病例，難以通過(guò)傳統(tǒng)微生物技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，而宏基因組測(cè)序使發(fā)現(xiàn)新病原成為可能。一名澳大利亞兒童的急性腹瀉樣本在使用分離培養(yǎng)、免疫學(xué)診斷、PCR等方法檢測(cè)后，輪狀病毒、星狀病毒、腺病毒和常見細(xì)菌等病原體結(jié)果均為陰性。Holtz等［54］采用宏基因組方法直接從糞便樣本提取RNA進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了一種與已知柯薩奇病毒相似的序列，通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)其基因序列不符合納入現(xiàn)有物種的標(biāo)準(zhǔn)，推測(cè)其為柯薩奇病毒屬內(nèi)新的物種并命名為Human Cosavirus E1（HCoSV-E1）。雖然這些病毒的流行和臨床意義目前未知，但這些病毒可能對(duì)人類健康產(chǎn)生影響，而宏基因組檢測(cè)能夠幫助了解這些病毒的免疫和發(fā)育信息并為預(yù)防和控制帶來(lái)新思路。

2.3 病原溯源

在調(diào)查傳染病疫情時(shí)，宏基因組學(xué)在對(duì)樣本進(jìn)行測(cè)序后，還可以構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹等對(duì)病原進(jìn)行追溯，找到潛在傳播途徑，及時(shí)確定和切斷感染源，進(jìn)而為制定公共衛(wèi)生策略提供重要依據(jù)。

寨卡病毒通過(guò)蚊蟲叮咬傳播，孕婦感染后可導(dǎo)致新生兒小頭癥，2016年寨卡病毒疫情暴發(fā)引起了廣泛的關(guān)注［55］。研究者通過(guò)對(duì)兩例孕婦患者的羊水樣本直接進(jìn)行高通量測(cè)序，檢測(cè)到寨卡病毒的全基因組，表明寨卡病毒可以穿過(guò)胎盤屏障感染胎兒，隨后利用PCR和ELISA驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)一步全基因組系統(tǒng)發(fā)育分析顯示其與法屬波利尼西亞的寨卡病毒具有97-100%的相似度，這為建立寨卡病毒和小頭癥的聯(lián)系及確定病毒來(lái)源提供了重要參考［56］。此外，Quick等［57］發(fā)展了直接對(duì)臨床樣本測(cè)序的方法，通過(guò)多重PCR富集病毒基因組，并同時(shí)采用MinION和Illumina進(jìn)行測(cè)序分析，可以得到病毒全部序列?；谏鲜龇椒?，Guerbois等［58］獲得感染患者的寨卡病毒序列，通過(guò)比對(duì)及溯源分析，發(fā)現(xiàn)該序列和北美地區(qū)埃及伊蚊中的病毒序列相似，推測(cè)病毒從危地馬拉傳入，并可能繼續(xù)向北擴(kuò)散，這為防止寨卡病毒進(jìn)一步傳播提供指導(dǎo)。

2011年，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院臨床中心暴發(fā)了耐碳青霉烯藥物病原疫情，造成18例感染和11例死亡。初始使用PCR和PFGE分析檢測(cè)到肺炎克雷伯菌，但未能進(jìn)一步區(qū)分患者菌株之間的差異以及對(duì)疫情深入研究。Snitkin等［59］使用宏基因組方法對(duì)此次疫情做了調(diào)查，測(cè)序得到菌株全基因組，序列分析顯示其屬于肺炎克雷伯菌NTUH-K2044型，并且檢測(cè)到碳青霉烯藥物的耐藥基因，之后通過(guò)分析全基因組序列確定菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查，推測(cè)病原在18位患者之間的傳播路徑。值得關(guān)注的是，宏基因組分析傳播路徑結(jié)果顯示病原不僅可以在相同病房?jī)?nèi)，還能在不同病房之間傳播，表明本次疫情可能具有更復(fù)雜的傳播方式，亟需加強(qiáng)對(duì)無(wú)癥狀人員和設(shè)備儀器等進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在應(yīng)對(duì)新突發(fā)疫情過(guò)程中，宏基因組方法能夠獲得樣本毒力耐藥信息，為治療提供幫助。此外，把基因組數(shù)據(jù)與流行病學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整體考慮，將遺傳信息與樣本提取的時(shí)間和位置結(jié)合，能夠有效對(duì)疫情調(diào)查追溯，推測(cè)病原傳播的過(guò)程和方式，對(duì)傳染病的傳播進(jìn)行阻斷。

流感病毒突變率和譜系可能對(duì)不同亞種的表型和抗原性起重要作用，對(duì)不同型別流感病毒進(jìn)化關(guān)系追溯有利于更深刻地認(rèn)識(shí)其變異傳播規(guī)律，從而為防控提供依據(jù)。Yu等［60］通過(guò)收集患者呼吸道樣本和當(dāng)?shù)丶仪菁S便、咽拭子等樣本，利用宏基因組測(cè)序方法，在人類樣本中檢測(cè)到H7N9病毒，在家禽樣本中則檢測(cè)到H7N9和H9N2的共存，并對(duì)人和家禽樣本均用PCR進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)H7N9的演化受到H9N2影響。

宏基因組得到病原基因組后，能準(zhǔn)確比對(duì)其序列，判斷病原源頭。2010年烏干達(dá)醫(yī)院報(bào)告疑似出血熱病例，McMullan等［61］從4名病人的血液樣本直接提取RNA進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)到黃熱病毒序列，系統(tǒng)發(fā)育分析將其與非洲各地報(bào)道過(guò)的毒株進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，以往烏干達(dá)出現(xiàn)的黃熱病毒與非洲東部和中部地區(qū)的序列具有同源性，并且大多數(shù)黃熱病毒具有地理聚集性。但是此次病例基因型不同于之前烏干達(dá)地區(qū)報(bào)道的基因組，而是與中非共和國(guó)特有的毒株具有相似性，揭示了可能的傳播來(lái)源。

利用宏基因組方法還可以對(duì)一些歷史疫情或病例進(jìn)行研究，從而對(duì)傳染病病原進(jìn)行時(shí)空溯源。Keller等［62］從冰木乃伊的骨骸中提取了0.1 g骨活性組織并進(jìn)行直接測(cè)序，檢測(cè)到伯氏疏螺旋體菌，識(shí)別到目前已知最早的萊姆病患者。研究者收集了來(lái)自英國(guó)、丹麥、瑞典的距今1010-1383年共計(jì)22例骨骼和牙齒樣本，使用宏基因組測(cè)序方法檢測(cè)到麻風(fēng)桿菌，并通過(guò)分析不同地區(qū)麻風(fēng)桿菌的序列差異，探究麻風(fēng)桿菌的起源與演變，推測(cè)美洲麻風(fēng)病可能來(lái)源于歐洲，并且中東地區(qū)麻風(fēng)桿菌基因型與中世紀(jì)歐洲地區(qū)基因型相關(guān)［63］。Chan等［64］對(duì)一名1797年的木乃伊肺部殘留組織樣本提取核酸后進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其受到分布在歐洲和北美地區(qū)的兩種不同基因型結(jié)核分枝桿菌的混合感染，這對(duì)研究結(jié)核分枝桿菌在世界范圍內(nèi)傳播的過(guò)程具有重要意義。

3 展望

雖然宏基因組學(xué)是一項(xiàng)強(qiáng)有力的工具，但是其仍有一些局限性待解決和進(jìn)一步發(fā)展。理論上宏基因組可以應(yīng)用于任何樣本，對(duì)不同類型病原體（如病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲等）都可以進(jìn)行檢測(cè)，但臨床、環(huán)境等樣本收集處理存在較多變量和不確定性，不同樣本所含微生物復(fù)雜程度不同，因此建立并優(yōu)化不同樣本收集及處理標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，有助于降低污染風(fēng)險(xiǎn)，并減少因分析流程不統(tǒng)一導(dǎo)致的分析結(jié)果偏差。

傳染病感染樣本復(fù)雜且含有大量非目的微生物核酸，當(dāng)樣本核酸濃度較低時(shí)，宏基因組測(cè)定序列難以實(shí)現(xiàn)致病病原高覆蓋，導(dǎo)致數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確率和可靠性下降，尤其是全基因組測(cè)序分析比16S rDNA擴(kuò)增分析需要更高的覆蓋，如何提高感染病原核酸濃度及宏基因組測(cè)序序列精度是一個(gè)值得考慮的問(wèn)題。且臨床樣本中人類基因組含量較高，在采取預(yù)防性措施的前提下，在50%-90%的序列中仍發(fā)現(xiàn)了人類基因，說(shuō)明去除樣本中人類核酸的技術(shù)仍存在較大發(fā)展空間［65］。此外，用于宏基因組分析的參考數(shù)據(jù)庫(kù)還不夠完善，大量測(cè)序數(shù)據(jù)無(wú)法進(jìn)行有效匹配，這對(duì)于病毒分析尤其嚴(yán)重，研究顯示80%或更多病毒的序列缺少與之相應(yīng)的匹配［66］。相比傳統(tǒng)檢測(cè)，宏基因組方法可將病原檢出率由12.82%（10/78）提高到30.77%（24/78），宏基因組測(cè)序雖然可以獲得樣本序列信息，但仍難以直接確認(rèn)致病病原，無(wú)法滿足診治需求，需要對(duì)其進(jìn)一步發(fā)展以適應(yīng)臨床需要［67］。

在病原識(shí)別后的生物信息學(xué)分析過(guò)程中，如何將臨床表型和基因型結(jié)合起來(lái)以及挖掘?qū)魅静》揽赜杏玫男畔⑹且粋€(gè)挑戰(zhàn)。解決這一問(wèn)題仍需要宏基因組學(xué)與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段相結(jié)合，如在宏基因組檢測(cè)到病原后使用PCR或分離培養(yǎng)方法進(jìn)行確認(rèn)，在檢測(cè)到耐藥基因后調(diào)整藥物治療方案以提高治療效果等。其次，有研究表明，在序列分析過(guò)程中，人類閱讀和分析隱私問(wèn)題也值得關(guān)注［68-69］，如何在病原檢測(cè)過(guò)程中盡可能地保護(hù)患者隱私，避免出現(xiàn)因基因組測(cè)序?qū)е碌膫惱韱?wèn)題，需要重點(diǎn)考慮。

在傳染病病原檢測(cè)中，時(shí)效性是一個(gè)重要問(wèn)題，病原診斷的周轉(zhuǎn)時(shí)間（Turn around time，TAT）是判斷病原檢測(cè)有效性的可靠指標(biāo)。Goswami等［70］進(jìn)行了為期一年的調(diào)查研究，對(duì)臨床樣本的TAT進(jìn)行評(píng)估，結(jié)論是住院樣本的TAT為5.5 h，門診樣本的TAT是24 h。針對(duì)臨床樣本的TAT，宏基因組測(cè)序和分析的速度亟需加快。如何提高測(cè)序速度是目前宏基因組發(fā)展的一個(gè)重要問(wèn)題。

宏基因組是一個(gè)有活力的領(lǐng)域，運(yùn)用宏基因組學(xué)技術(shù)進(jìn)行病原監(jiān)測(cè)、檢測(cè)和溯源，應(yīng)對(duì)新突發(fā)傳染病疫情，成功打開了宏基因組學(xué)在公共衛(wèi)生和疾病防控領(lǐng)域的應(yīng)用大門，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，宏基因組學(xué)分析流程和算法也不斷更新和完善。宏基因組學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用也正在受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。

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