miRNA29靶基因CCND2和CDK6在宮頸癌中的表達研究

沈樹娜，王　輝，宮本麗

(內蒙古醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，內蒙古 包頭 014010)

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，細胞周期的失控與腫瘤的發(fā)生有著明顯的相關性[1-2]。miRNA是廣泛存在于真核生物體中的一組內源性非編碼單鏈小分子RNA，其中微小核糖核酸29(microRNA，miRNA29)在多種惡性腫瘤中低表達，其通過靶向細胞周期素D2重組蛋白(recombinant cyclin D2，CCND2)和周期蛋白依賴性激酶6(cyclin-dependent kinases，CDK6)參與細胞周期的調控和宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[3-4]，本實驗采用逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測宮頸鱗狀細胞癌組織中CCND2、CDK6表達情況并分析了二者在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的相互作用。

1材料與方法

1.1材料

收集2015年6月至2017年1月內蒙古醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院婦科宮頸癌手術切除標本20例，因宮頸上皮內瘤變子宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)行宮頸錐切標本24例，因子宮肌瘤行全子宮切除標本 20例，所有病例均經(jīng)病理確診。宮頸癌(病理結果均為宮頸鱗狀細胞癌)患者術前均未接受放化療，按年齡可分為：≥40歲16例，<40歲4例；按臨床分期，Ⅰ期6例，Ⅱ期14例；按有無淋巴結轉移可分為：有淋巴結轉移者2例，無淋巴結轉移18例；按病理組織學分級可分為：中、低分化9例，高分化11例。

1.2研究方法

實驗中新鮮標本均經(jīng)病理醫(yī)師取材，收取組織在術中離體后馬上收取，立即予生理鹽水漂洗去除血跡，置于組織涼存管，立即放入液氮速凍，然后移至冰箱保存直至使用。采用RT-PCR 檢測宮頸鱗狀細胞癌組織、CIN組織、正常宮頸組織中CCND2、CDK6的信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)水平。

1.3統(tǒng)計學方法

采用Sigma State軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，多組計量資料比較采用Kruskal-Wallis檢驗，兩組比較采用Mann-Whitney 檢驗。CCND2和CDK6相關性分析采用Spearman相關分析。采用雙側檢驗，檢驗水準為α=0.05，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 miRNA29靶基因CCND2在三組中的表達

miRNA29靶基因CCND2在正常宮頸組織、CIN組織和宮頸鱗狀細胞癌組織中的相對表達量平均值為0.00140859、0.00204650、0.01702534。經(jīng)統(tǒng)計學分析，CCND2在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達水平與CIN組織相比顯著上調，差異有統(tǒng)計學意義(U=60.00，P<0.05),在正常宮頸組織與CIN組織的表達水平相比，差異無統(tǒng)計學意義(U=184.00，P>0.05),在宮頸鱗狀細胞癌組織的表達水平與宮頸正常上皮組織相比顯著上調，差異有統(tǒng)計學意義(U=16.00，P<0.05)。結果見表1和圖1。

表1CCND2在正常宮頸組織、CIN組織、宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達

Table 1Expressions of CCND2 in normal cervical tissues, CIN tissues and tissue of cervical squamous cell carcinoma

編號分組例數(shù)(n)CCND2平均值HP1UP21宮頸鱗狀細胞癌組200．0170253460．00<0．05?2CIN組240．0020465029．27<0．05184．00>0．05??3正常宮頸組200．0014085916．00<0．05???

注：P1為三組間比較，P2為兩組間比較；*為1、2組比較，**為2、3組比較，***為1、3組比較。

2.2 miRNA29靶基因CDK6在三組中的表達

miRNA29靶基因CDK6在正常宮頸組織、CIN組織和宮頸鱗狀細胞癌組織中的相對表達量平均值為0.00104340、0.00028625、0.00066675，CDK6在正常宮頸組織、CIN組織、宮頸鱗狀細胞癌組織中表達無統(tǒng)計學差異(H=2.76，P>0.05)。結果見表2，圖1。

表2CDK6在正常宮頸組織、CIN組織、宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達

Table 2Expressions of CDK6 in normal cervical tissues, CIN tissues and tissue of cervical squamous cell carcinoma

編號分組例數(shù)(n)CDK6平均值HP1宮頸鱗狀細胞癌組200．000666752CIN組240．000286252．76>0．053正常宮頸組200．00104340

圖1宮頸鱗狀細胞癌組織中CCND2、CDK6 PCR產(chǎn)物電泳圖

Fig.1Electrophoretogram of PCR production of CCND2 and CDK6 in cervical squamous cell carcinoma tissue

2.3 miRNA29靶基因CCND2和CDK6在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的相關性

采用Spearman相關分析分別結果顯示：在CIN組織中,CCND2與CDK6表達呈正相關，結果有統(tǒng)計學意義(r=0.58，P<0.05)，宮頸鱗狀細胞癌組織中CCND2和CDK6相關性分析，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 miRNA29調控的CCND2在宮頸癌組織不同臨床病理特征方面比較

進一步分析宮頸鱗狀細胞癌組織中CCND2表達與患者臨床病理特征的關系，發(fā)現(xiàn)CCND2表達與宮頸鱗狀細胞癌患者的病理分化程度方面的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05) ；淋巴結轉移方面因分布不均而無法比較。而在FIGO分期、年齡方面的比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05) ，見表3。

表3宮頸鱗狀細胞癌組織中CCND2的表達與臨床病理特征的關系

Table 3Relationship between the expression of CCND2 and clinicopathological features incervical squamous cell carcinoma tissue

臨床病理特征例數(shù)(n)CCND2平均值UP年齡(歲)　≥40140．0195724839．00>0．05　<4060．01108203淋巴結轉移　陽性20．02367749--　陰性180．01628622FIGO分期?、?0．0100217423．00>0．05?、?40．02002689組織分化程度　高分化110．0074172923．00<0．05　中、低分化90．028768521

2.5 miRNA29靶基因CCND2在CIN組織中的表達

CIN組分為兩組：CINⅠ/Ⅱ組、CINⅢ組。結果顯示，CCND2在CINⅢ組中的表達明顯高于CINⅠ/Ⅱ組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4CCND2在CIN組織中的表達

Table 4Expression of CCND2 in CIN tissue

組別例數(shù)(n)CCND2平均值UPCINⅠ/Ⅱ130．001176324．00<0．05CINⅢ110．00327582

3 討論

3.1miRNA29與惡性腫瘤

miRNA29是miRNA中的成員之一，在多種癌癥中異常表達，如乳腺癌、胃癌、宮頸癌等。miRNA29通過靶向CCND2參與細胞周期的調控，抑制宮頸癌的發(fā)生，宮頸癌組織中CDK6是miRNA29是靶基因，通過調控細胞周期參與宮頸癌的發(fā)生。

3.2 CCND2與宮頸腫瘤

CCND2是D型細胞周期蛋白的成員，其在細胞周期調節(jié)，分化和惡性轉化中起關鍵作用[4]。鄒冬玲等[5]發(fā)現(xiàn)CCND2在宮頸癌組織中表達上調，且發(fā)現(xiàn)miRNA29通過靶向CCND2參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。本研究結果表明，與正常宮頸組織、CIN組織相比，宮頸鱗狀細胞癌組織中CCND2的表達水平上調，差異有統(tǒng)計學意義，且與病理分級有關；在正常宮頸組織和CIN組織中CCND2表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義。而在CIN中的CINⅠ/Ⅱ組、CINⅢ組中的表達存在差異，差異具有統(tǒng)計學意義。本實驗結果說明miRNA29靶基因CCND2在早期宮頸病變中(CINⅠ/Ⅱ組)無顯著異常表達，隨著宮頸病變的進展發(fā)揮作用，可能促進腫瘤細胞生長，由于病理分級是惡性腫瘤預后的重要指標，因此CCND2在判斷宮頸癌的預后評估中具有較為重要的臨床意義。

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3.3 CDK6與宮頸腫瘤

CDK6是CDK家族中的一員，在絲裂原誘導下，與細胞周期蛋白 D 結合，參與細胞周期的調節(jié)。目前已發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤存在CDK6 基因擴增、過表達或細胞周期抑制因子缺乏、突變導致的 CDK6活性增強[6]。miRNA29可能是與HPV致癌過程關系最為密切的miRNA，可能通過細胞周期等生物學功能參與HPV相關的宮頸癌發(fā)生過程，提示miRNA29可能是宮頸鱗狀細胞癌相關的抑癌miRNA。王輝等[7]研究通過免疫組化發(fā)現(xiàn)CDK6的蛋白水平在宮頸癌組織中的表達明顯上調。而本實驗結果顯示在正常宮頸組織、CIN組織、宮頸鱗狀細胞癌組織中表達比較，差異無統(tǒng)計學意義，與文獻報道不一致。該結果的出現(xiàn)可能因為CDK6僅是較大細胞周期、信號傳導系統(tǒng)的一部分，且本研究存在樣本量不足等缺陷，因而需進一步擴大樣本量及定量測試蛋白水平以確定miRNA29靶基因CDK6在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

3.4 CCND2和CDK6在宮頸腫瘤中的相關性

本研究通過RT-PCR測試CCND2和CDK6在宮頸癌已經(jīng)CIN組織中的表達，并通過統(tǒng)計學方法分析其相關性。結果示CCND2和CDK6的表達水平在宮頸鱗狀細胞癌組織中無相關性，而在CIN組織中存在正相關，說明miRNA29靶基因CCND2和CDK6在CIN組織中可能起協(xié)同作用，為進一步探索miRNA29在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的機制，本研究下一步可在大樣本量的前提下繼續(xù)研究檢測，隨著宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，研究miRNA29靶基因CCND2及CDK6的關系，以進一步探索miRNA29在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的機制，可為miRNA29可成為宮頸癌診斷和治療的一個新靶點提供一定的理論依據(jù)。

[參考文獻]

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[7]王輝,沈樹娜,王俊飛.宮頸癌組織中CDK6的表達及臨床意義[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2013,23(34):60-62.