銀杏無菌苗培養(yǎng)方法的優(yōu)化

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(揚州大學園藝與植物保護學院，　江蘇 揚州 225009)

銀杏(GinkgobilobaL.)為銀杏科銀杏屬的落葉喬木，具有極高的藥用、食用和觀賞等價值。比如，銀杏的種子中含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、脂肪、鈣、磷、鐵、胡蘿卜素等，還含有內(nèi)酯、膽固醇、聚戊醇等有效成分，對于心腦血管疾病具有良好的療效[1]。近年來，銀杏葉因含有黃酮和萜內(nèi)酯等有效成分而受到關注，其提取物對消除自由基、抗腫瘤、抗氧化及保護神經(jīng)系統(tǒng)有著重要的作用[2]。此外，由于銀杏栽培管理方便，壽命長，觀賞性能好，已經(jīng)成為城市園林綠化的主要樹種。銀杏的繁殖可通過播種、嫁接、扦插以及組織培養(yǎng)等方式。隨著銀杏的發(fā)開和利用，對于銀杏的需求量日漸增大，而植物組織培養(yǎng)可快速繁殖優(yōu)質(zhì)種苗。因此，加強銀杏組織培養(yǎng)技術的研究，對促進銀杏無性系育種，工業(yè)化生產(chǎn)銀杏次生代謝產(chǎn)物以及銀杏研究具有重要意義。

銀杏組織培養(yǎng)開始于20世紀30年代[3]，主要以銀杏的營養(yǎng)器官、花粉、配子體等為材料進行培養(yǎng)[4-11]。如Choi等[9]對銀杏的未成熟胚進行了研究，Tommasi等[10]用銀杏葉進行了組織培養(yǎng)，陳穎[8]等用銀杏無菌苗各部位莖段為外植體，研究其不同位置的莖段芽萌發(fā)和不定芽的分化情況。然而前人的研究大多直接使用滅菌后的銀杏器官進行培養(yǎng)，容易造成組織培養(yǎng)過程中的污染，組織培養(yǎng)的成功率較低。此外，銀杏組織培養(yǎng)目前還沒有一個高效的快繁體系。為了獲取無菌材料，更好的用于后期組織培養(yǎng)，本研究分別以銀杏種核和種胚為試驗材料，研究不同外植體、培養(yǎng)基和胚乳汁對銀杏無菌苗生長的影響，篩選適合銀杏無菌苗生長的培養(yǎng)基配方，為進一步進行銀杏組織培養(yǎng)提供技術支持。

1　材料與方法

1.1　實驗材料

銀杏種子在2016年10月23日于揚州大學銀杏資源圃(32°39′E，119°42′N)采集。銀杏種子外種皮不經(jīng)腐熟直接去掉，流水洗凈晾干后常溫貯藏。2017年1月，以除去中種皮的銀杏種子、種胚進行接種。

1.2　實驗方法

1.2.1材料處理

將銀杏種子去除中種皮后，在無菌條件下，經(jīng)75%的酒精浸泡5 min，17%次氯酸鈉消毒20 min，用無菌水沖洗3次，然后用無菌的濾紙吸去材料表面的水分。銀杏種胚用解剖刀將種子從脊部切開，將種胚取出。

1.2.2培養(yǎng)基成分

以WPM、MS為基本培養(yǎng)基，分別在WPM培養(yǎng)基中添加35 g蔗糖和7 g瓊脂，MS培養(yǎng)基中添加35 g蔗糖和7.5 g瓊脂，并附加1%、3%、5%等3種不同濃度的銀杏胚乳汁液。培養(yǎng)基pH值為5.6～5.8。詳細配比如下：

1) 木本專用培養(yǎng)基+1%胚乳提取液(成熟胚)；

2) 木本專用培養(yǎng)基+3%胚乳提取液(成熟胚)；

3) 木本專用培養(yǎng)基+5%胚乳提取液(成熟胚)；

4) 木本專用培養(yǎng)基(成熟胚)；

5) MS+3%胚乳提取液(成熟胚)；

6) 木本專用培養(yǎng)基(種核)。

表1不同接種材料的無菌苗生長情況

接種材料污染率(%)發(fā)芽率(%)芽苗高度(cm)葉片數(shù)(片)生根率(%)平均生根數(shù)(條)主根長側(cè)根率(%)種核84．0012．507．8512．500．137．20．00成熟胚2．0072．001．7742．05696．0016．0234．00

表2不同胚乳汁濃度下無菌苗的生長情況

胚乳汁濃度(%)污染率(%)發(fā)芽率(%)芽苗高度(cm)葉片數(shù)(片)生根率(%)平均生根數(shù)(條)主根長側(cè)根率(%)02．0072．001．7742．05696．0016．0234．00132．0041．181．1182．07188．240．913．252．94338．0096．771．9613．23396．771．357．9226．67528．0091．671．5783．06197．221．496．4225．00

1.2.3培養(yǎng)條件及指標測定

銀杏無菌苗培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照強度為2 000～3 000 lx，16 h光照，8 h黑暗。培養(yǎng)60 d后對污染率、發(fā)芽率、芽苗高度、平均葉片數(shù)、生根率、平均生根數(shù)及主根長進行測定。在結果統(tǒng)計中所涉及的測定項目計算公式如下：

污染率(%)=污染的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%；

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽的外植體/接種的外植體數(shù)×100%；

平均葉片數(shù)=每處理葉片的總數(shù)/發(fā)芽的無菌苗數(shù)；

生根率(%)=生根的外植體/接種的外植體數(shù)×100%；

側(cè)根率(%)=產(chǎn)生側(cè)根的外植體/接種的外植體數(shù)×100%；

平均生根數(shù)=每處理生根的總數(shù)/生根的無菌苗數(shù)；

主根長=每處理主根的總長度/生根的無菌苗數(shù)。

2　結果與分析

2.1　不同接種材料無菌苗生長情況的影響

首先對試驗材料進行篩選，分別以發(fā)育成熟并完成生理后熟的銀杏種核和分離出的成熟種胚為材料，接種到WPM培養(yǎng)基中。結果表明，接種材料對無菌苗的生長情況影響顯著。以種胚為接種材料(圖1-a至1-c)的污染率僅為2%，顯著低于以種核為接種材料(圖1-d至1-f)的無菌苗的污染率(高達84%)。此外，以種胚為接種材料，其發(fā)芽率和生根率，分別達到72.00%和96.00%，均遠高于種核并且種胚所長成的無菌苗有部分出現(xiàn)側(cè)根，而以種核為接種材料的無菌苗則沒有側(cè)根。以種胚為接種材料，其無菌苗(圖1-b)萌發(fā)出芽的時間明顯早于種核(圖1-e)，但生長速率較慢。在無菌苗生長60 d時，以種胚為接種材料的無菌苗，其芽苗高度和平均葉片數(shù)目要顯著低于種核長成的無菌苗。綜上所述，銀杏無菌苗的接種材料以成熟胚的效果最佳，污染率低，發(fā)芽率及生根率均較高，無菌苗萌發(fā)出芽時間較早，但其生長速度較慢。

2.2　胚乳汁對無菌苗生長情況的影響

為了提高以種胚為接種材料的無菌苗的生長速率，將銀杏胚乳榨汁后加入WPM培養(yǎng)基中，并設置0%，1%，3%和5%共4種胚乳汁的濃度梯度(表2)。結果表明，在培養(yǎng)至29 d時，添加了1%胚乳汁的培養(yǎng)基中無菌苗生長速度最慢(圖1-g)，而添加3%胚乳汁的培養(yǎng)基中無菌苗生長速度最快(圖1-h)，其次為添加5%胚乳汁濃度下的無菌苗的生長速度(圖1-i)。結果表明，加入1%胚乳汁(圖1-j)的發(fā)芽率顯著低于其他處理，而加入3%(圖1-k)和5%(圖1-l)胚乳汁的無菌苗發(fā)芽率和生根率均高于其他處理，達到90%以上。然而，與對照相比，加入胚乳汁的培養(yǎng)基污染率均較高，分別為32%，38%和28%，而對照(圖1-f)的污染率僅為2%。此外，加入3%和5%胚乳汁的無菌苗葉片數(shù)略多于其他處理，平均到達3片/株，側(cè)根生長情況也較好(圖1-m至1-n)，側(cè)根率分別為26.67%和25%。尤其3%胚乳汁的芽苗高度最高，主根長度最長，分別達到1.961 cm和7.92 cm。而添加5%的胚乳汁對于銀杏無菌苗生長高度具有一定的抑制，為1.578 cm。綜上分析表明，胚乳汁顯著影響了銀杏無菌苗的生長，且以添加3%胚乳汁效果最佳。

2.3　不同培養(yǎng)基對無菌苗生長情況的影響

在明確了最佳接種材料和胚乳汁添加濃度的基礎上，進一步篩選最佳培養(yǎng)基。以分離出的銀杏種胚為接種材料，分別采用MS和WPM 2種培養(yǎng)基，并添加3%胚乳汁(表3)。不同培養(yǎng)基的實驗結果顯示，WPM培養(yǎng)基中無菌苗(圖1-k)的發(fā)芽率遠高于MS培養(yǎng)基(圖1-o)，高出約33%。此外，雖然MS培養(yǎng)基中無菌苗的生根率達到81.82%，但是無側(cè)根發(fā)生，且芽苗的生長高度較低，為1.24 cm。而WPM培養(yǎng)基生長的無菌苗生根率、發(fā)芽率及芽苗高度等均較好，分別達到96.77%，96.77%和1.961 cm，且側(cè)根的發(fā)生率也高達26.67%。綜上所述，WPM培養(yǎng)基并添加3%胚乳汁更適于以銀杏種胚為接種材料的無菌苗的培養(yǎng)。

注：a～c為銀杏種胚長成無菌苗(a為接種后1 d；b為接種后29 d；c為接種后60 d)；d～f為銀杏種核長成無菌苗(d為接種后1 d；e為接種后29 d；f為接種后60 d)；g～i為1%，3%，5%的胚乳汁濃度下29 d的無菌苗；j～l為1%，3%，5%的胚乳汁濃度下60 d的無菌苗；m～n為3%，5%無菌苗側(cè)根生長情況；o為以MS為基本培養(yǎng)基，附加3%胚乳汁濃度培養(yǎng)基的無菌苗。圖1　銀杏種子無菌苗的培養(yǎng)

表3不同培養(yǎng)基中無菌苗的生長情況

培養(yǎng)基類型污染率(%)發(fā)芽率(%)芽苗高度(cm)葉片數(shù)(片)生根率(%)平均生根數(shù)(條)主根長側(cè)根率(%)WPM+3%胚乳汁38．0096．771．9613．23396．771．357．9226．67MS+3%胚乳汁78．0063．641．2402．57181．820．824．470．00

3　討　論

銀杏為較為古老的裸子植物，在組織培養(yǎng)過程中易出現(xiàn)褐化、生根難等問題，組織培養(yǎng)的難度較大。陳穎等[8]通過對無菌苗的莖段進行分別培養(yǎng)，建立了銀杏組培莖段快繁體系。因此，在銀杏的組織培養(yǎng)中，無菌外植體的獲得非常重要[12]。但由于銀杏種核體積較大，往往滅菌不徹底造成污染，影響無菌苗的培養(yǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)，將進行滅菌處理后的種核剖開分離出種胚，采用種胚接種后污染率可顯著下降。此外，因為銀杏受精作用發(fā)生遲，受精過程復雜，從而造成了成熟采收后的種子中無胚率較高，一般可達40%～50%，這部分種子即使完成了生理后熟也不能萌發(fā)生長成幼苗。因此，采用種胚為接種材料，還可大大提高萌發(fā)率和無菌苗的數(shù)量。

王伏雄等研究發(fā)現(xiàn)，蜂王漿和椰子乳汁對銀杏幼胚生長發(fā)育有很大影響[13-14]。其中，蜂王漿對于銀杏幼胚的器官分化和發(fā)育具有明顯的促進作用。而椰子乳汁對促進幼胚分化生長的作用也較明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，以銀杏種核為接種材料的無菌苗基本都能生根，而以種胚為接種材料的無菌苗生根率則較低。分析二者的差別主要在于種核具有胚乳結構，可在后期種胚萌發(fā)過程中提供充足的養(yǎng)分，而分離出的種胚脫離了胚乳組織，有效的養(yǎng)分供應顯著減少，因此猜測銀杏胚乳對于種胚生根可能具有一定作用。將銀杏胚乳榨汁后加入培養(yǎng)基，進行高壓消毒，分別設置不同的濃度梯度，發(fā)現(xiàn)銀杏胚乳汁對于銀杏種胚的生長及生根的確產(chǎn)生一定的促進作用，尤其添加3%的胚乳汁后，發(fā)芽率，芽苗高度，生根率和側(cè)根發(fā)生率均顯著提高。

對于銀杏的組織培養(yǎng)，前人多采用MS培養(yǎng)基[15-16]、改良MS培養(yǎng)基[16-17]以及White培養(yǎng)基等[18]。本研究主要采用的是WPM培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基為木本植物培養(yǎng)基，是由Lloyd和McCown于1980年開發(fā)的一種低濃度的培養(yǎng)基，適合于多種木本植物的培養(yǎng)。以銀杏種胚為接種材料，比較MS培養(yǎng)基+3%胚乳汁和WPM培養(yǎng)基+3%胚乳汁，結果表明，WPM培養(yǎng)基加入胚乳汁后，無菌苗的發(fā)芽率、芽苗高度、主根和側(cè)根生長情況較高，說明培養(yǎng)基對銀杏無菌苗的培養(yǎng)產(chǎn)生影響，篩選出WPM添加3%胚乳汁的最優(yōu)培養(yǎng)基配方，而MS培養(yǎng)基所適應的胚乳汁濃度依然需要進行進一步的實驗明確。

參考文獻：

[1]史垠垠.白果飲料加工工藝及穩(wěn)定性研究[D].南京:南京林業(yè)大學,2010.

[2]李保同.銀杏葉總黃酮的提取純化及其抗氧化性能研究[D].北京:北京林業(yè)大學,2016.

[3]桂仁意,曹福亮.銀杏組織培養(yǎng)研究進展[J].南京林業(yè)大學學報(自然科學版),2004,28(3):99-104.

[4]任鵬斌,王阿姣,李波,等.銀杏葉片愈傷組織誘導的激素組合培養(yǎng)條件分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學,2016,55(1):216-219.

[5]慕瑩,趙曉燕,景丹龍,等.銀杏不同組織器官及愈傷組織培養(yǎng)中端粒酶活性測定[J].北京林業(yè)大學學報,2014,36(3):95-99.

[6]秦小舒,逯巖,郁萬文,等.不同發(fā)育階段銀杏胚的組織培養(yǎng)研究[J].北方園藝,2014(23):87-90.

[7]盛麗莉.NaCl和Ce3+對銀杏懸浮細胞生長和黃酮代謝的影響[D].南京:南京林業(yè)大學,2012.

[8]陳穎,曹福亮,徐彩平,等.不同部位銀杏莖段培養(yǎng)及位置效應的研究[J].浙江林業(yè)科技,2010,30(1):28-31.

[9]Choi PS,Cho DY,Soh WY.Shoot Organogenesis from Immature Zygotic Embryo Cultures ofGinkgobiloba[J].Biologia Plantarum,2003,47(2):309-312.

[10]Tommasi F,Scaramuzzi F.In vitro,Propagation ofGinkgobiloba,by Using Various Bud Cultures[J].Biologia Plantarum,2004,48(2):297-300.

[11]Phongtongpasuk S,Piemthongkham P.Shikimic Acid Production fromGinkgobilobavia Callus Culture[J].Advanced Materials Research,2014,931:1 524-1 528.

[12]蔣時姣,鐘宇,張帆,等.柳杉種子無菌苗組培快繁體系的建立[J].植物生理學報,2014,50(7):1 039-1 044.

[13]王伏雄,陳祖鏗,李憲章.銀杏幼胚離體培養(yǎng)的研究Ⅰ.蜂皇漿對幼胚生長的影響[J].Journal of Integrative Plant Biology,1963,11(3):217-224.

[14]王伏雄,陳祖鏗.銀杏幼胚離體培養(yǎng)的研究——椰子乳汁對幼胚生長的影響[J].植物學報,1965,13(3):224-239.

[15]陳穎,徐彩平,盛麗莉,等.銀杏胚的培養(yǎng)及不定芽的產(chǎn)生[J].廣西植物,2011,31(5):679-683.

[16]袁紅慧,李琳玲,程華,等.銀杏幼胚培養(yǎng)的多因子正交試驗研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學,2012,41(1):117-121.

[17]王蓮輝,鄧龍玲,楊方成,等.銀杏快速繁殖及脫毒技術研究[J].中國野生植物資源,2003,22(2):53-55.

[18]崔剛,唐蕾,王武.培養(yǎng)基和外源激素對銀杏愈傷組織誘導、生長及葉綠素含量的影響[J].食品與生物技術學報,2008,27(2):117-122.