睡美人轉(zhuǎn)座子在草魚CIK細(xì)胞中介導(dǎo)的高效基因整合

陳　凱　薛　亭　王藝舟　潘啟華　于　淼,　陳天圣

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070; 2. 河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 河南省水產(chǎn)動物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心, 新鄉(xiāng) 453007)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是生物學(xué)研究中的一個熱點(diǎn), 構(gòu)建穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因魚類細(xì)胞系對研究魚類基因功能和轉(zhuǎn)基因魚具有重要價值。在魚類細(xì)胞中, 外源基因整合效率偏低, 穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系難以獲得, 因此尋找一種穩(wěn)定高效的轉(zhuǎn)基因方法在魚類轉(zhuǎn)基因研究中尤為重要。

睡美人(Sleeping Beauty, SB)轉(zhuǎn)座子屬于Tc1/mariner轉(zhuǎn)座子家族, 普遍存在于脊椎動物基因組中。但在生物體漫長進(jìn)化過程中由于突變累積失去了活性。1997年Ivics等[1]在鮭科魚類基因組中運(yùn)用生物信息學(xué)方法恢復(fù)了轉(zhuǎn)座子的活性。SB轉(zhuǎn)座子能攜帶外源DNA在轉(zhuǎn)座酶的催化作用下, 以“剪切和粘貼”的方式發(fā)生轉(zhuǎn)座, 偏向于隨機(jī)插入基因組中TA序列處[2]。2009年Mates等[3]通過高通量定點(diǎn)突變得到目前轉(zhuǎn)座活性最高的轉(zhuǎn)座酶SB100X,它能顯著提高SB轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座效率。SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是一種很好的基因轉(zhuǎn)移載體, 具有整合效率高、外源基因能長期穩(wěn)定表達(dá)、低拷貝整合、插入位點(diǎn)隨機(jī)分布等特點(diǎn), 因此它被廣泛運(yùn)用于轉(zhuǎn)基因、插入誘變、基因治療等研究中[4]。其他轉(zhuǎn)座子如piggyBac[5]、Tol2[6]、Tgf2[7]等也常被作為基因轉(zhuǎn)移載體, 但有研究表明SB轉(zhuǎn)座子比piggyBac和Tol2轉(zhuǎn)座子具有更高的轉(zhuǎn)座活性[8,9]。SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)能在體細(xì)胞[10]、T細(xì)胞[11]、干細(xì)胞[12]等多種細(xì)胞中介導(dǎo)外源基因高效整合。Gallardo-Galvez等[13]發(fā)現(xiàn)了SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在多種魚類細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)座活性。SB轉(zhuǎn)座子也運(yùn)用于獲得轉(zhuǎn)基因魚, He等[14]將攜帶外源基因的SB轉(zhuǎn)座子載體和SB11轉(zhuǎn)座酶mRNA共同顯微注射至羅非魚受精卵中, 待轉(zhuǎn)基因羅非魚發(fā)育成熟后與野生型成魚雜交, 在F1和F2代羅非魚基因組中均能檢測到外源基因的存在。此外運(yùn)用SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)已經(jīng)成功獲得了多種轉(zhuǎn)基因動物, 如小鼠[15]、豬[16]、牛[17]、斑馬魚[18]等。因此SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)能在轉(zhuǎn)基因研究中發(fā)揮重要作用。

目前有關(guān)SB轉(zhuǎn)座子和具有高效活性的SB100X轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)在魚類細(xì)胞中轉(zhuǎn)座效率和整合位點(diǎn)的研究鮮有報(bào)道, 草魚(Ctenopharyngodon idellus)全基因序列圖譜的完成也為鑒定轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)提供了重要基礎(chǔ)[19]。因此本實(shí)驗(yàn)以草魚CIK細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料, 構(gòu)建了以DsRed為外源報(bào)告基因的SB一元和二元轉(zhuǎn)座子系統(tǒng), 以不同比例的轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶共轉(zhuǎn)染CIK細(xì)胞, 用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀和實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測了外源基因DsRed的轉(zhuǎn)染和整合效率, 通過高效熱不對稱交互式PCR(hiTAIL-PCR)擴(kuò)增出轉(zhuǎn)座子在基因組中插入位點(diǎn)的DNA序列并對整合位點(diǎn)進(jìn)行初步分析, 為利用SB轉(zhuǎn)座子在魚類細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高效基因整合和構(gòu)建大規(guī)模的突變庫奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　菌種、質(zhì)粒和細(xì)胞

感受態(tài)大腸桿菌(Escherichia coli) DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司, 載體pT2/BH由Perry Hackett饋贈(Addgene plasmid #26556),SB100X轉(zhuǎn)座酶載體pCMV (CAT) T7-SB100(pSB)由Zsuzsanna Izsvak饋贈(Addgene plasmid#34879), 載體pCV-pr由新加坡國立大學(xué)洪云漢教授饋贈, pIRES-DsRed質(zhì)粒和草魚CIK細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2　睡美人轉(zhuǎn)座子載體構(gòu)建

在pCV-pr質(zhì)粒上設(shè)計(jì)引物Pr-F和Pr-R (表1),以pCV-pr質(zhì)粒為模板通過PCR擴(kuò)增得到2.4 kb報(bào)告元件CMV-Pac-DsRed, 用ClonExpress II試劑盒(Vazyme, 南京)將其連接至用BglⅡ和EcoRⅤ酶切的pT2/BH線性化質(zhì)粒上, 構(gòu)建成SB轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體pT2, 它與轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體pSB共同組成SB二元反式(trans)轉(zhuǎn)座系統(tǒng)。在pSB質(zhì)粒上設(shè)計(jì)引物SBF和SB-R(表1), 以pSB為模板通過PCR擴(kuò)增得到1.3 kb的SB轉(zhuǎn)座酶片段; 在SB轉(zhuǎn)座子pT2上設(shè)計(jì)引物T2Pr-F和T2Pr-R(表1), 以pT2為模板PCR擴(kuò)增得到2.9 kb的轉(zhuǎn)座子表達(dá)元件T2/CMV-Pac-DsRed, 用ClonExpress II試劑盒(Vazyme, 南京)將SB轉(zhuǎn)座酶片段和T2/CMV-Pac-DsRed片段連接至NotⅠ和NheⅠ酶切的pIRES-DsRed線性化質(zhì)粒, 構(gòu)建成SB一元反式(cis)轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體pT2_SB, 所有酶切正確的質(zhì)粒送公司測序(武漢擎科生物)。

1.3　不同比例轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶共轉(zhuǎn)染細(xì)胞

在12孔板中接種密度為1×105個/孔的CIK細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時用LipofectamineTM2000(Invitrogen, 美國)轉(zhuǎn)染CIK細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個實(shí)驗(yàn)組, 每組3個重復(fù), 第1組： 轉(zhuǎn)染一元轉(zhuǎn)座子pT2_SB;第2組： 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)座子pT2; 第3組： 轉(zhuǎn)染pT2∶pSB=10∶1;第4組： 轉(zhuǎn)染pT2∶pSB=2∶1; 第5組： 轉(zhuǎn)染pT2∶pSB=1∶2。轉(zhuǎn)染48h后在熒光顯微鏡下觀察, 統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總數(shù)和紅色熒光細(xì)胞數(shù)目, 計(jì)算得到各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中紅色熒光細(xì)胞比例。隨后對各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行嘌呤霉素篩選, 細(xì)胞培養(yǎng)基中添加1 μg/mL嘌呤霉素, 每3d換1次含嘌呤霉素的培養(yǎng)基, 持續(xù)4周。

1.4　流式細(xì)胞儀分析

嘌呤霉素篩選4周后, 在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。使用BD FACSVerseTM細(xì)胞分析儀(BD, 美國)測定各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中DsRed陽性細(xì)胞比例及相對熒光強(qiáng)度, 每個實(shí)驗(yàn)組測定細(xì)胞數(shù)為1×104個, 對照組為未轉(zhuǎn)染的CIK細(xì)胞。

1.5　總RNA提取和半定量PCR

用Trizol裂解法提取嘌呤霉素篩選4周后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞RNA, 分別取1 μg RNA用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa, 日本)試劑盒合成第一鏈cDNA。半定量PCR引物根據(jù)外源基因DsRed序列設(shè)計(jì), 其序列為DsRed-F和DsRed-R(表1), 目的帶為150 bp。草魚β-actin基因(M25013.1)作為內(nèi)參, 引物為β-actin-F和β-actin-R(表1), 目的條帶為154 bp。20 μL的半定量PCR體系包括2×Taq Master Mix (Takara, 日本) 10 μL、雙蒸水8 μL、上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)和cDNA 1 μL。半定量PCR反應(yīng)條件為： 94℃ 3min; 94℃ 20s, 58℃ 30s,72℃ 15s, 35個循環(huán); 72℃ 10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1　本研究所用的引物序列Tab. 1　Primers used in this study

1.6　熒光定量PCR

以各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的cDNA為模板, DsRed-F和DsRed-R為引物(表1), 用Bio-rad CFX Connet實(shí)時定量PCR儀(Bio-rad, 美國)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),檢測DsRed相對表達(dá)量, 草魚β-actin作為內(nèi)參基因(表1)。20 μL PCR反應(yīng)體系包括2×SYBR?Premix Ex TaqTM(Takara, 日本)10 μL、RNA-free水6.8 μL、上下游引物各0.6 μL (10 μmol/L)和cDNA 2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?95℃ 2min; 95℃ 5s, 58℃ 20s,39個循環(huán); 65℃緩慢上升至95℃(0.5℃/5 s)。每個樣品采用3個平行, DsRed的相對表達(dá)量用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.7　基因組DNA提取和高效熱不對稱交互式PCR

用蛋白酶K消化法提取穩(wěn)定表達(dá)DsRed的CIK細(xì)胞(pT2∶pSB=1∶2組)基因組DNA, 以它為模板進(jìn)行hiTAIL-PCR反應(yīng), 根據(jù)轉(zhuǎn)座子載體pT2上的反向重復(fù)序列(IR/DR)設(shè)計(jì)3條特異性引物SP1、SP和SP3(表1), 分別用于第1輪、第2輪和第3輪hi-TAIL-PCR反應(yīng)。簡并引物L(fēng)AD1、LAD2、LAD3、LAD4和AC1(表1), 各輪PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序均參考Liu等[20]。對第2輪和第3輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆并送公司測序, 測序序列與草魚基因組序列(http：//www.ncgr.ac.cn/grasscarp/)進(jìn)行比對, 分析SB轉(zhuǎn)座子在草魚基因組中的插入位點(diǎn)。

2　結(jié)果

2.1　轉(zhuǎn)座子pT2和pT2_SB的構(gòu)建

通過PCR方法構(gòu)建得到SB轉(zhuǎn)座子載體pT2, 與轉(zhuǎn)座酶載體pSB構(gòu)成了SB二元反式(trans)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)(圖1A)。同時也構(gòu)建了SB轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶表達(dá)框在同一個質(zhì)粒上的一元順式(cis)轉(zhuǎn)座子載體pT2_SB (圖1B)。所構(gòu)建的SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)都包含CMV啟動子、嘌呤霉素抗性基因和DsRed報(bào)告基因。

2.2　不同轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的瞬時轉(zhuǎn)染效率

設(shè)置5個實(shí)驗(yàn)組, 用不同轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)染CIK細(xì)胞, 分別轉(zhuǎn)染一元轉(zhuǎn)座子pT2_SB、轉(zhuǎn)座子pT2(未加轉(zhuǎn)座酶)、pT2∶pSB=10∶1、pT2∶pSB=2∶1和pT2∶pSB=1∶2。48h后, 在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光,分析得到5組細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染效率分別為8.3%、10.7%、12.8%、9.1%和6.7%(圖2), 表明SB轉(zhuǎn)座子pT2與轉(zhuǎn)座酶pSB比例為10∶1時, DsRed瞬時轉(zhuǎn)染效率最高(12.8%)。

2.3　不同轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的整合效率

嘌呤霉素篩選4周后, 在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)添加轉(zhuǎn)座酶pSB的實(shí)驗(yàn)組(pT2∶pSB=10∶1、2∶1、1∶2)大部分細(xì)胞表達(dá)出紅色熒光蛋白, 并形成密集的細(xì)胞群, 而轉(zhuǎn)染一元轉(zhuǎn)座子pT2_SB組和僅轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)座子pT2組紅色熒光細(xì)胞數(shù)量比較少(圖3A)。

用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞中紅色熒光細(xì)胞比例,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pT2_SB、pT2、pT2∶pSB=10∶1、pT2∶pSB=2∶1和pT2∶pSB=1∶2這5個實(shí)驗(yàn)組中, 紅色熒光細(xì)胞比例分別為58.0%、26.6%、89.9%、87.1%和94.1%(圖2)。表明轉(zhuǎn)座子pT2與轉(zhuǎn)座酶pSB比例為1∶2時, 外源基因DsRed整合效率最高, 達(dá)到94.1%(圖3B)。隨后檢測DsRed相對熒光強(qiáng)度, 發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子pT2與轉(zhuǎn)座酶pSB比例為1∶2時, 細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度也最大, 是僅轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)座子pT2組熒光強(qiáng)度的21.6倍, 是轉(zhuǎn)染一元轉(zhuǎn)座子pT2_SB組熒光強(qiáng)度的8.7倍(圖3C)。

圖1　SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1　The structure of SB transposon system

圖3　嘌呤霉素篩選后CIK細(xì)胞中DsRed的表達(dá)檢測Fig. 3　The detection of DsRed in CIK cells after puromycin selection

采用半定量PCR驗(yàn)證外源基因DsRed在CIK細(xì)胞中的表達(dá)情況, 發(fā)現(xiàn)在5個實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中均檢測出清晰的目的條帶, 對照組沒有檢測到條帶(圖3D), 說明外源DsRed片段已經(jīng)插入基因組中并且能夠轉(zhuǎn)錄為mRNA。進(jìn)一步用熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞中DsRed的相對表達(dá)量, 結(jié)果表明轉(zhuǎn)座子pT2與轉(zhuǎn)座酶pSB比例為1∶2時, DsRed相對表達(dá)量最高, 是僅轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)座子pT2組的15.3倍, 是轉(zhuǎn)染一元轉(zhuǎn)座子pT2_SB組的3.3倍(圖3E)。

2.4　插入位點(diǎn)的分析

采用hiTAIL-PCR擴(kuò)增SB轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)上下游未知的DNA片段, 第2輪和第3輪PCR反應(yīng)中可以得到出清晰條帶(圖4), 共獲得了大小為49—623 bp的24個片段。與草魚基因組序列比對后得到了7個不同位點(diǎn)的插入序列, 編號為1—7(表2), 1—6號能準(zhǔn)確定位于草魚基因組中, 其中1、5和6號有多個序列重復(fù), 2、3、4和7號為單一序列, 而且這18個插入序列與轉(zhuǎn)座子末端連接處都為TA二核苷酸,說明了SB轉(zhuǎn)座子偏向于隨機(jī)整合至草魚基因組中TA位置, 此外在24個片段中還有6個片段測序確證為轉(zhuǎn)座子pT2自身載體的一部分。

3　討論

為了研究睡美人轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在魚類細(xì)胞的整合效率以及轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的特性, 本實(shí)驗(yàn)利用SB轉(zhuǎn)座子在草魚CIK細(xì)胞中進(jìn)行了測試。結(jié)果表明SB二元轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的整合效率遠(yuǎn)高于一元轉(zhuǎn)座子系統(tǒng), SB轉(zhuǎn)座子與SB100X轉(zhuǎn)座酶比例為1∶2時外源基因DsRed的整合效率最高, 而且SB轉(zhuǎn)座子在草魚基因組中偏向于隨機(jī)整合至TA位置。

圖4　插入序列的hiTAIL-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 4　Gel electrophoretogram of hiTAIL-PCR products

表2　SB轉(zhuǎn)座子在草魚基因組中的插入位置Tab. 2　Inserted sites of SB transposon in grass carp genome

在不同物種或細(xì)胞中SB轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)染比例能影響外源基因整合效率。Kolacsek等[21]發(fā)現(xiàn)在人HEK-293細(xì)胞中, SB轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶比例為1∶2時, 外源基因轉(zhuǎn)染效率最高; Podetz-Pedersen等[22]在小鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)SB轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶比例為50∶1時, 轉(zhuǎn)座效率最高; 周家慶等[23]在豬胎兒成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)SB轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶比例為1∶1時, 外源基因表達(dá)量最高。本實(shí)驗(yàn)用流式細(xì)胞儀和qPCR檢測SB一元轉(zhuǎn)座子和不同轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶比例的二元轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在CIK細(xì)胞中的整合效率, 發(fā)現(xiàn)SB轉(zhuǎn)座子pT2與轉(zhuǎn)座酶pSB比例為1∶2時, 外源基因DsRed整合效率最高, 這可能是由于適量的轉(zhuǎn)座酶促進(jìn)更多拷貝插入基因組, 因此優(yōu)化轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶的比例可以提高整合效率。此外SB二元(trans)系統(tǒng)整合效率也高于一元(cis)系統(tǒng), 這可能是由于在一元系統(tǒng)中, 轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶在DNA水平的相對比例為1∶1, 高比例轉(zhuǎn)座酶的持續(xù)表達(dá)產(chǎn)生了更高的細(xì)胞毒性, 使轉(zhuǎn)座活性下降。Huang等[24]報(bào)道在T細(xì)胞中SB二元轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)整合效率至少是一元轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)3倍; Podetz-Pedersen等[22]在小鼠肝臟中檢測到SB二元轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)整合效率大約是一元轉(zhuǎn)座子的5倍, 這些結(jié)果都與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。此外有研究報(bào)道SB轉(zhuǎn)座酶可通過mRNA或者蛋白質(zhì)的形式與轉(zhuǎn)座子共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞[25,26], 可以降低細(xì)胞毒性, 提高轉(zhuǎn)座子整合效率。在轉(zhuǎn)染效率較低的CIK細(xì)胞中, 經(jīng)長期的藥物篩選后, 加入SB二元轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)組熒光細(xì)胞比例大幅提高, 而沒有加入轉(zhuǎn)座酶的細(xì)胞熒光比例較低, 表明SB100X轉(zhuǎn)座酶能顯著促進(jìn)外源基因在魚類細(xì)胞中的整合。

有研究對SB轉(zhuǎn)座子插入序列特性進(jìn)行大量分析, 發(fā)現(xiàn)SB轉(zhuǎn)座子傾向于隨機(jī)整合到基因組TA序列處, 沒有明顯插入基因內(nèi)或轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的傾向[2,27], 而其他轉(zhuǎn)座子如piggyBac和Tol2, 它們偏向于插入基因內(nèi)或轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近[28,29], 可能使細(xì)胞產(chǎn)生有害突變, 甚至使細(xì)胞死亡。因此SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是一種更安全的轉(zhuǎn)基因載體, 在插入誘變和基因治療等研究中能發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)用hi-TAIL-PCR方法在草魚基因組中快速獲得6個不同的轉(zhuǎn)座子插入序列, 它們都定位于基因組TA位置,表明在草魚基因組中SB轉(zhuǎn)座子也偏好于插入TA的位置, SB轉(zhuǎn)座子在基因組中插入的偏好性對今后開展轉(zhuǎn)座子定向插入的研究具有重要意義。此外有部分?jǐn)U增序列為轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒pT2本身片段, 表明SB轉(zhuǎn)座子可能發(fā)生了自我整合[30], 或者質(zhì)粒是以其他方式插入到基因組中。

Gallardo-Galvez等[13]用SB11轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)染了5種不同的魚類細(xì)胞, 包括大馬哈魚CHSE-214細(xì)胞、虹鱒RTG-2細(xì)胞、太陽魚BF-2細(xì)胞、鯉EPC細(xì)胞和鯛SAF-1細(xì)胞, 只在CHSE-214細(xì)胞中SB11轉(zhuǎn)座酶能顯著提高轉(zhuǎn)座效率, 未能獲得轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用具有高效活性的轉(zhuǎn)座酶SB100X在草魚細(xì)胞中顯著提高了外源基因整合效率, 并快速得到了轉(zhuǎn)座子在草魚基因組的插入位點(diǎn)?；赟B轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)具有整合基因組的高效性、插入位點(diǎn)的隨機(jī)性、鑒定插入位點(diǎn)的快速性等優(yōu)點(diǎn), 我們還在青魚(Mylopharyngodon piceus)、中華鱘(Acipenser sinensis)、石斑魚(Epinephelussp)等魚類細(xì)胞進(jìn)行了測試, 也證實(shí)在SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)能顯著提高外源基因整合效率, 快速獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系(未發(fā)表結(jié)果)。綜上所述, 本實(shí)驗(yàn)在草魚細(xì)胞中優(yōu)化了SB轉(zhuǎn)座子與SB100X轉(zhuǎn)座酶的比例, 研究了SB轉(zhuǎn)座子整合的特性, 提供了一種利用SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在魚類細(xì)胞實(shí)現(xiàn)高效基因整合的方法, 為構(gòu)建魚類細(xì)胞突變體庫奠定了理論基礎(chǔ)。

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