62例熱性驚厥患者的SCN3A基因突變篩查分析*

陳勇軍，劉稀金，何 娜，石奕武，曹 琳，李 欣，何妍妍，易毅利

(1.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南衡陽 421002；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)研究所，廣州 510120)

熱性驚厥(febrile seizures，F(xiàn)S)是與發(fā)熱及年齡相關(guān)的兒童時(shí)期最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，體溫38.5℃以上容易發(fā)作，發(fā)病年齡一般在3個(gè)月到6歲，患病率為3%～5%。發(fā)作形式多樣化，但最多見為強(qiáng)直陣攣發(fā)作。電壓門控鈉離子通道基因突變是FS的最常見病因，家族性患者中更為多見[1]。SCN1A基因是與FS關(guān)系最為密切的基因[2-3]，迄今發(fā)現(xiàn)突變最多，其次是SCN2A基因突變[4]。SCN1A、SCN2A和SCN3A為鈉通道的不同亞型，基因定位相似[5]，功能特性上可能具有相似性，SCN3A基因突變是否與FS相關(guān)，值得深入的研究。因此本研究就62例FS患者的SCN3A基因突變篩查分析報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 病例來源于2012年1月至2016年2月在南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科及小兒科，以及廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院癲癇中心就診的FS患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 起病年齡在3個(gè)月至6歲，由于急性發(fā)熱而誘發(fā)的全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作，但排除顱內(nèi)感染或腦損傷等疾??；(2)FS持續(xù)到6歲以后，或出現(xiàn)無熱驚厥，發(fā)作形式表現(xiàn)為部分性和或全面性發(fā)作；(3) 性別及就診年齡不限。選取100 名健康志愿者作為對(duì)照。本研究經(jīng)所在醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入組對(duì)象簽署知情同意書。參照文獻(xiàn)將入組患者分為4類[6-7]，依次為：FS、部分性癲癇伴熱性驚厥附加征(partial epilepsy with febrile seizures plus,PEFS+)、全面性癲癇伴熱性驚厥附加征(generalized epilepsy with febrile seizures plus,GEFS+)、嬰兒重癥肌陣攣性癲癇(severe myoclonic epilepsy in infancy,SMEI)。共入組患者62例，男38例，女24例，首發(fā)年齡(2.3±0.5)歲。分類診斷為單純的熱性驚厥8例，熱性驚厥附加征(FS+)11例，PEFS+13例，GEFS+17例，SME 13例。62例中有FS家族史15例，另47例為散發(fā)；28例智能發(fā)育差，34例智能正常。發(fā)作形式表現(xiàn)出多樣化，其中復(fù)雜部分性發(fā)作(complex partial seizure，CPS)27例，全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作(generalized tonic-clonic seizure，GTCS) 15例，繼發(fā)性GTCS(secondary GTCS，sGTCS)17例，失神9例，肌陣攣18例，強(qiáng)直16例，陣攣24例，10例表現(xiàn)出癲癇持續(xù)狀態(tài)，其他發(fā)作形式8例。腦電圖有局灶性棘慢波發(fā)放的22例，全面性棘慢復(fù)合波16例，未見明顯放電的17例，其他7例。影像學(xué)提示有異常的13例，如大腦皮質(zhì)發(fā)育不良、皮質(zhì)局灶性低密度影、海馬萎縮等。藥物以丙戊酸鈉口服液使用最多，其次奧卡西平、卡馬西平、拉莫三嗪、托吡酯、氯硝西泮等，單藥治療控制較好的23例，其余使用二聯(lián)或三種以上藥物。

1.2方法

1.2.1DNA提取 采集了熱性驚厥患者及健康志愿者的外周靜脈血4 mL，采用美國(guó)基因技術(shù)有限公司提供的Quick-Gene-610L及QuickGenen mini80基因組DNA快速提取試劑盒抽提DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物合成 參照LIAO等[7]的研究合成引物，序列覆蓋外顯子編碼區(qū)和內(nèi)含子-外顯子剪切區(qū)，由上海生工生物有限公司合成，GenBank號(hào)為SCN3A(NM066922)。

A:c.905A>G/p.N302S；B：c.5179G>A/p.D1727N；C：c.1441C>T/p.L481L；紅色箭頭：突變位點(diǎn)；黑色箭頭：正常對(duì)照

圖1 SCN3A基因突變位點(diǎn)測(cè)序圖

1.2.3基因篩查策略 PCR方法擴(kuò)增SCN3A 基因全部外顯子，使用東盛生物科技有限公司的Taq DNA酶和2×HSTM Reaction Mix冰上配置 PCR體系(基因組200 ng+正反向引物各5 μL+Mix 25μL+Taq酶0.5 μL+ddH2O至50 μL，引物工作濃度為10 μmol/L)，摸索合適的條件擴(kuò)增外顯子片段，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，若產(chǎn)物特異性好，則連同引物送至北京六合華大基因有限公司測(cè)序。采用Vector-NTI-V8.0生物軟件進(jìn)行序列比對(duì)，并對(duì)發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)做與健康人的對(duì)照。

1.2.4生物軟件分析 對(duì)于發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)，采用Clustalx1行保守性分析及Mutation Taster軟件預(yù)測(cè)其致病性。

2 結(jié) 果

2.1發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn) 檢測(cè)了62例患者，共發(fā)現(xiàn)2例雜合錯(cuò)義突變(c.905A>G/p.N302S，c.5179G>A/p.D1727N)和1例多態(tài)性位點(diǎn)(c.1441C>T/p.L481L)，見圖1。c.905A>G導(dǎo)致了氨基酸302位的遺傳密碼子由AAT變成AGT，使得天冬酰氨被絲氨酸取代，該突變位于第6號(hào)外顯子上，父母親DNA驗(yàn)證提示來源于母親。c.5179G>A導(dǎo)致遺傳密碼子由GAC變成AAC，1727位天冬氨酸被天冬酰氨取代，位于第26號(hào)外顯子上，父母親中沒有發(fā)現(xiàn)相同位點(diǎn)改變，提示為新生突變。另外在10例患者和18名健康者中存在c.1441C>T變異，考慮為多態(tài)性位點(diǎn)，遺傳密碼子由CTG變成TTG，但編碼的亮氨酸不變，為同義突變(L481L)。

2.2突變位點(diǎn)致病性分析 兩個(gè)錯(cuò)義突變都位于在鈉離子通道的孔區(qū)，前者在DⅠ S5～S6，后者在DⅣ S5～S6，見圖2。在人的分布于神經(jīng)系統(tǒng)鈉通道亞型中(如SCN1A、SCN2A、SCN3A、SCN4A、SCN8A、SCN9A 、SCN10A)及哺乳動(dòng)物大鼠小鼠中序列一致，見圖2。在100名健康者中沒有發(fā)現(xiàn)同樣的變異， Mutation Taster 軟件分析在ExAC 和千人基因組計(jì)劃中沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的突變位點(diǎn)。

A:突變位點(diǎn)在鈉離子通道上的位置示意圖；B：突變位點(diǎn)的保守性分析

圖2突變位點(diǎn)位置示意圖及保守性分析

2.3典型病例 2例突變患者為1男1女，首發(fā)年齡分別為6.0歲和3.5歲，都以FS起病，發(fā)熱大于38.5 ℃，1例有家族史，其姑媽2～5歲時(shí)有FS，此后未有再發(fā)。發(fā)作形式上1例表現(xiàn)為全面性發(fā)作，另1例為部分性發(fā)作為主，間斷繼發(fā)全面性發(fā)作。2例都有智能障礙，尤其是語言功能有明顯受損。腦電圖分別提示為全面性慢波及局灶性慢波發(fā)放， MRI提示1例正常，1例左側(cè)海馬信號(hào)略高。治療上都是聯(lián)合兩種以上藥物，癥狀才得以緩解，診斷分別為GEFS+和PEFS+，結(jié)果見表1。

表1 2例錯(cuò)義突變患者的臨床特征

VPA：丙戊酸鈉； LTG：拉莫三嗪； OXC：奧卡西平；LEV：左乙拉西坦

3 討 論

FS是兒童中最常見的發(fā)作類型，復(fù)發(fā)性熱性驚厥是成年后顳葉癲癇的危險(xiǎn)因素之一。FS的發(fā)病機(jī)制是多因素的，大家系連鎖分析揭示了FS是常染色體顯性遺傳模式，目前已經(jīng)有11個(gè)染色體位點(diǎn)上存在有FS基因定位[8]，命名為FEB1～FEB11，其中位點(diǎn) FEB3(2q23～24)與 SCN1A、SCN2A 和 SCN3A 基因在2號(hào)染色體上的簇集位置一致，功能特性上具有相似性，與癲癇發(fā)作有關(guān)[9]。SCN1A和SCN2A基因突變都已經(jīng)明確與FS相關(guān)。SCN3A基因與SCN1A及SCN2A的位置相近，分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，亞細(xì)胞定位于神經(jīng)元的胞體和樹突，但是SCN3A突變是否與熱性驚厥相關(guān)，沒有專門的研究報(bào)道。2014年VANOYE等[10]在局灶性癲癇患兒中報(bào)道了4個(gè)新的SCN3A突變，其中1例存在M1323V突變的患兒，16個(gè)月大時(shí)僅表現(xiàn)為單純性熱性驚厥發(fā)作。該突變可能是SCN3A基因中第一個(gè)被報(bào)道與FS相關(guān)的突變位點(diǎn)。

本研究在62例FS患者中進(jìn)行SCN3A篩查，僅發(fā)現(xiàn)2例錯(cuò)義突變以及1例多態(tài)性位點(diǎn)，突變率僅為3.23%(2/62)，在100名健康對(duì)照中未發(fā)現(xiàn)相同位點(diǎn)改變，生物信息學(xué)分析表明2個(gè)突變點(diǎn)保守性高，在ExAC和千人基因組計(jì)劃中沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的突變位點(diǎn)，有可能是致病性突變。有研究利用陣列CGH技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在1例癲癇患兒中的2號(hào)染色體上存在12 Mb長(zhǎng)度的鈉通道集群的缺失，該缺失片段覆蓋了SCN3A基因，該患者同時(shí)存在FS發(fā)作及智能障礙[11]。本文中發(fā)現(xiàn)的2例突變患者都存在中度或重度智能障礙，在伴有智能障礙的FS患者中的SCN3A的突變率為7.14%(2/28)，而在34例智能正常的患者中無突變發(fā)現(xiàn)，因此伴有智能障礙者中的突變率高于總突變率，可能是因?yàn)镾CN3A突變與智能障礙相關(guān)，最近的文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)一步支持SCN3A與兒童智能相關(guān)[12]。當(dāng)然這一現(xiàn)象的進(jìn)一步確認(rèn)，需要后續(xù)更大樣本去做驗(yàn)證。

FS具有非常明確的遺傳易感性，已報(bào)道與多種基因突變相關(guān)，而且患者同胞的患病率較普通人群至少高20%[13]，所以在家族性中發(fā)病應(yīng)該更為常見。對(duì)于發(fā)現(xiàn)的基因突變?nèi)绾螌?dǎo)致癲癇的發(fā)生，仍然是非常復(fù)雜的問題，鈉離子通道基因發(fā)生突變后導(dǎo)致了通道的功能發(fā)生了改變，進(jìn)一步的功能研究有助于闡明基因突變導(dǎo)致癲癇發(fā)作的分子機(jī)制[14]，構(gòu)建體外細(xì)胞模型進(jìn)行膜片鉗電生理功能研究是一種重要的探索[15]。

[1]GUPTA A.Febrile Seizures[J].Continuum(Minneap Minn),2016,22(1):51-59.

[2]NAKAYAMA J,ARINAMI T.Molecular genetics of febrile seizures[J].Epilepsy Res,2006,70 Suppl 1:S190-198.

[3]NAKAYAMA J.Progress in searching for the febrile seizure susceptibility genes[J].Brain Dev,2009,31(5):359-365.

[4]SHI X,YASUMOTO S,KURAHASHI H,et al.Clinical spectrum of SCN2A mutations[J].Brain Dev,2012,34(7):541-545.

[5]WEISS A,ESCAYG A,KEARNEY A,et al.Sodium channels SCN1A,SCN2A and SCN3A in familial autism[J].Mol Psychiatry,2003,8(2):186-194.

[6]BAULAC S,GOURFINKEL-AN I,NABBOUT R,et al.Fever,genes,and epilepsy[J].Lancet Neurol,2004,3(7):421-430.

[7]LIAO W P,SHI Y W,LONG Y S,et al.Partial epilepsy with antecedent febrile seizures and seizure aggravation by antiepileptic drugs:associated with loss of function of Na(v) 1.1[J].Epilepsia,2010,51(9):1669-1678.

[8]SAGHAZADEH A,MASTRANGELO M,REZAEI N.Genetic background of febrile seizures[J].Rev Neurosci,2014,25(1):129-161.

[9]YOSHITOMI S,TAKAHASHI Y,ISHIZUKA M,et al.Three patients manifesting early infantile epileptic spasms associated with 2q24.3 microduplications[J].Brain Dev,2015,37(9):874-879.

[10]VANOYE C G,GURNETT C A,HOLLAND K D,et al.Novel SCN3A variants associated with focal epilepsy in children[J].Neurobiol Dis,2014,62(62):313-322.

[11]VECCHI M,CASSINA M,CASARIN A,et al.Infantile epilepsy associated with Mosaic 2q24 duplication including SCN2A and SCN3A[J].Seizure,2011,20(10):813-816.

[12]THURESSON A C,VAN BUGGENHOUT G,SHETH F,et al.Whole gene duplication of SCN2A and SCN3A is associated with neonatal seizures and a normal intellectual development[J].Clin Genet,2017,91(1):106-110.

[13]IWASAKI N,NAKAYAMA T,HAMANO T,et al.Molecular genetics of febrile seizures[J].Epilepsia,2002,43(9):32-35.

[14]LAMAR T,VANOYE C G,CALHOUN J,et al.SCN3A deficiency associated with increased seizure susceptibility[J].Neurobiol Dis,2017,102(11):38-48.

[15]CHEN Y J,SHI Y W,XU H Q,et al.Electrophysiological differences between the same pore region mutation in SCN1A and SCN3A[J].Mol Neurobiol,2015,51(3):1263-1270.