基質(zhì)金屬蛋白酶檢測在非小細(xì)胞肺癌中的意義*

趙 璞，楊軍峰，何 苡

(河南省人民醫(yī)院胸外科一區(qū),鄭州 450000)

肺部腫瘤是目前危害人類生命健康的重要病因之一，會產(chǎn)生巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)壓力。隨著人口老齡化程度加劇及空氣質(zhì)量的不斷惡化，肺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，目前已與肝癌、消化系統(tǒng)腫瘤共同成為城市居民死亡的重要病因[1]。癌癥細(xì)胞的局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是腫瘤危害人體健康的主要手段，目前研究證實基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2，-9，-14及調(diào)控MMP家族相關(guān)蛋白的信號素3A和FoxM1對腫瘤的局部浸潤和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移有明確的調(diào)控作用[2]。本研究將應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)，對非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者手術(shù)切除的癌癥組織中MMP-9和MMP-14的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，同時對患者進(jìn)行為期5年的臨床隨訪，探討MMP-9和MMP-14表達(dá)水平和患者預(yù)后的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料方法

1.1一般資料 收集2010年6月16日至2011年8月9日于本院胸外科癌癥病房，接受肺癌根治性手術(shù)治療的NSCLC患者84例，納入患者均未接受術(shù)前放化療治療，其中男61例，女23例；年齡55～79歲；手術(shù)標(biāo)本經(jīng)病理切片認(rèn)定為NSCLC，其中鱗狀細(xì)胞癌53例，腺癌29例，大細(xì)胞癌2例；結(jié)合薄層高分辨率CT診斷，并根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)制訂的第8版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[3]：本研究納入患者中T1a期15例，T1b期22例，T1c期15例，T2a期16例，T2b期7例，T3期7例，T4期2例；N0期68例，N1期12例，N2期4例，M0期84例；TNM分期ⅠA期41例，ⅠB期15例，ⅡA期5例，ⅡB期16例，ⅢA期7例。免疫組織化學(xué)檢測用兔抗人MMP-9和MMP-14多克隆抗體購置于Sigmaaldrich公司，免疫組織化學(xué)試劑盒購置于武漢谷歌生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1病理標(biāo)本采集 患者行薄層高分辨率CT檢查確定病變部位及病變分期，待術(shù)前檢查完善，一般情況穩(wěn)定后行肺癌根治性手術(shù)治療。完整切除病變后取10%切緣組織進(jìn)行術(shù)中冰凍病理切片檢查，取10%癌組織甲醛固定，常規(guī)進(jìn)行石蠟包埋處理以備后續(xù)實驗，剩余組織于液氮中保存。另收集良性肺部病變接受手術(shù)切除組織作為陰性對照，收集病例分型為鱗癌和腺癌的胃癌標(biāo)本作為陽性對照?；颊咝g(shù)后常規(guī)接受化療，每半年隨訪一次并復(fù)查CT，記錄手術(shù)至死亡時間，計算生存率。本研究納入患者全部簽署知情同意書，治療過程依從性良好，無患者失訪。

1.2.2實驗方法 根據(jù)免疫組織化學(xué)試劑盒相關(guān)說明，并結(jié)合文獻(xiàn)[4]進(jìn)行操作，癌癥組織經(jīng)石蠟包埋后以4 μmol/L厚度連續(xù)切片，常規(guī)進(jìn)行脫蠟、脫水后，用枸櫞酸進(jìn)行抗原修復(fù)5 min，用3%甲醇過氧化氫液阻斷20 min。兔抗人MMP-9和兔抗人MMP-14多克隆抗體1∶200稀釋，一抗37 ℃孵育60 min，二抗37 ℃孵育30 min，二氨及聯(lián)苯胺(DAB)顯色、蘇木素復(fù)染并用透明樹膠封片。陰性對照及陽性對照組織采用相同處理。

1.2.3判定標(biāo)準(zhǔn) 抗原抗體相結(jié)合將產(chǎn)生棕黃色顆粒狀免疫復(fù)合物定義為陽性產(chǎn)物。于高倍鏡下觀察細(xì)胞，可見陽性產(chǎn)物多聚集于細(xì)胞表面或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，較少見于細(xì)胞核。根據(jù)每個細(xì)胞中的陽性產(chǎn)物的染色強度及出現(xiàn)范圍確定陽性細(xì)胞，當(dāng)400倍鏡若干視野中，每200個細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)量大于50個，即陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)大于25%時，記為該組織中MMP-9或MMP-14呈陽性表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1MMP-9與MMP-14表達(dá)與患者性別和病理分型的關(guān)系 在性別方面，MMP-9與MMP-14表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。MMP-9和MMP-14陽性表達(dá)率與組織分型無關(guān)，見表1。

2.2MMP-9表達(dá)與癌細(xì)胞TNM分期的相關(guān)性 在T2和T3～4期與T1期細(xì)胞中MMP-9表達(dá)量對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義；N0組中MMP-9陽性率(48.5%)明顯低于N1～3期陽性率(87.5%)； MMP-9在Ⅱ期和Ⅲ期細(xì)胞中表達(dá)量也明顯較Ⅰ期細(xì)胞高。在TNM分期的組間對比中，MMP-14差異無統(tǒng)計學(xué)意義。MMP-14與細(xì)胞N分期不具有相關(guān)性，見表2。

2.3MMP-9與癌癥復(fù)發(fā)及生存率的相關(guān)性 5年內(nèi)癌癥復(fù)發(fā)患者M(jìn)MP-9陽性率明顯高于未復(fù)發(fā)患者；MMP-14的表達(dá)差異在患者5年內(nèi)復(fù)發(fā)方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義；在復(fù)發(fā)患者M(jìn)MP-14陽性率明顯高于未復(fù)發(fā)患者，在出現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶患者中高達(dá)100%，且MMP-14表達(dá)率與患者5年生存率無相關(guān)性,MMP-9與癌癥復(fù)發(fā)及生存率有相關(guān)性，見表3。

表1 MMP-9及MMP-14蛋白表達(dá)與患者性別及組織分型的關(guān)系[n(%)]

表2 MMP-9及MMP-14蛋白表達(dá)與TNM分期的關(guān)系[n(%)]

a：P<0.05，與T1期比較；b：P<0.05，與Ⅰ期比較

表3 MMP-9及MMP-14蛋白表達(dá)與癌癥復(fù)發(fā)及患者生存率的關(guān)系[n(%)]

3 討 論

基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)目前已經(jīng)分離鑒定出26種亞型，分為膠原酶、活化型MMP、分泌性MMP、明膠酶、基質(zhì)降解素和基質(zhì)溶解素6大類[5]，MMP-9屬于金屬蛋白酶家族中明膠酶，該家族蛋白在保持生物活性時需要鋅離子的存在，同時鈣離子也可以有效維持其穩(wěn)定性，因該蛋白需要金屬離子的輔助作用而得名。該蛋白家族內(nèi)部結(jié)構(gòu)相似，主要由5個不同的功能結(jié)構(gòu)域組成，包括疏水信號肽區(qū)、前肽區(qū)、催化活性區(qū)、鉸鏈區(qū)和羥基末端，其中前肽區(qū)是MMP蛋白酶原被外源性切酶激活的主要位點，而催化活性區(qū)則具有高度的保守性。MMP家族成員雖然在基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)方面有較大差異，但都以細(xì)胞外基質(zhì)為主要消化底物，同一種MMP對多種細(xì)胞外基質(zhì)有效，但酶解效率有較大差異，因該蛋白具有降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的功能，能夠有效破壞癌癥細(xì)胞浸潤和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的組織屏障，因此在腫瘤的侵襲中起到了至關(guān)重要的作用。

細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是存在于細(xì)胞外，主要維持細(xì)胞正常生理活性，由膠原和蛋白聚糖等生物大分子構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)框架，這些大分子通過細(xì)胞表面的特異性受體，與細(xì)胞骨架相連接，參與細(xì)胞生理活動。MMP-9因?qū)儆诿髂z酶，對細(xì)胞外基質(zhì)中明膠，Ⅳ和Ⅴ型膠原蛋白極強的水解作用，MMP-14則屬于Ⅳ膜型MMPs蛋白，主要的水解產(chǎn)物是酶原型MMP-2，可以有效激活細(xì)胞表面MMP-2蛋白，MMP-2屬于Ⅱ型明膠原酶，對Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型膠原蛋白和彈性蛋白有強烈的水解作用[6]?？偠灾?，MMP-9和MMP-14的激活，對細(xì)胞外基質(zhì)可以產(chǎn)生嚴(yán)重的破壞作用，損傷正常組織對腫瘤的屏障功能，是癌癥細(xì)胞侵襲力增加，導(dǎo)致腫瘤組織轉(zhuǎn)移的重要因素。有研究顯示，乳腺癌細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移與MMP-2和MMP-9表達(dá)增高有關(guān)，肺癌的局部浸潤與MMPs表達(dá)增高也有明顯相關(guān)性[7]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，MMP-14在T2期癌細(xì)胞中表達(dá)的陽性率為95.7%，明顯高于T1組細(xì)胞，可以說腫瘤細(xì)胞的大小與MMP-14 表達(dá)有明顯相關(guān)性，但與癌癥細(xì)胞是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移則無明顯統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性，可以說明，MMP-14主要激活MMP-2，增強了對局部組織的破壞程度，更有利于腫瘤組織的局部侵害性[8]。但由于大細(xì)胞癌比例較小，仍需要大樣本研究證實該結(jié)果。

MMPs表達(dá)升高有利于腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的另一個重要原因是，MMPs對細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行降解的同時，有效清除了血管內(nèi)皮細(xì)胞向正常組織中浸潤的有效屏障，而血管生成則是腫瘤細(xì)胞快速生長，向遠(yuǎn)端組織侵襲并定植的主要推動者[9-11]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，MMP-9的表達(dá)，與腫瘤的T分期有明顯相關(guān)性，T2期和T3～4期的腫瘤組織中表達(dá)明顯高于T1期腫瘤組織，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的肺癌組織中，MMP-9表達(dá)也明顯升高，術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)的患者中，11例出現(xiàn)了遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的新病灶，而組織張MMP-9表達(dá)陽性率明顯增高，也說明MMP-9對細(xì)胞外基質(zhì)的破壞作用。MMP-9和MMP-14的表達(dá)增高對患者的預(yù)后也有判斷價值，5年內(nèi)復(fù)發(fā)的23例病例中，MMP-9陽性率為82.6%，MMP-14陽性率為95.7%，都明顯高于未復(fù)發(fā)患者中的表達(dá)，而出現(xiàn)遠(yuǎn)端病灶的患者中，MMP-9和MMP-14表達(dá)陽性率高達(dá)100.0%，盡管與未出現(xiàn)MMP-9和MMP-14陽性表達(dá)的患者比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但也高于其71.4%和92.9%的比例，可以說，MMP-9與MMP-14對非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后預(yù)測有臨床意義[12]。

MMPs活性受金屬基質(zhì)蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)的抑制作用，但由于其體外提純難度較大和體內(nèi)合成有收到多種蛋白信號通路調(diào)控，作為藥物用于臨床抑制癌癥侵襲仍有較大難度[13]。目前已知的具有抑制MMPs生物功能的物質(zhì)有長鏈不飽和脂肪酸，其長鏈結(jié)構(gòu)對MMP-2與纖維蛋白原結(jié)合域有干擾作用；多酚和黃酮類化合物也對MMP-2，-7，-9和-14抑制作用明顯，并可以參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞遷移能力，其中具有代表性的就是咖啡酸，一種廣泛存在于橄欖油、咖啡、水果和蔬菜中的多酚類化合物[14-15]。健康豐富的飲食習(xí)慣也可以從一定程度上預(yù)防癌癥的發(fā)生和進(jìn)展。

[1]許紅，毛德強，王燕．重慶市女性腫瘤發(fā)病率及年齡特征分析[J]．重慶醫(yī)學(xué)，2010，39(11)：1422-1423,1447．

[2]周海英，吳愛萍，李巖，等．信號素3A和基質(zhì)金屬蛋白酶-14在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義[J]．中華胸心血管外科雜志，2014，30(9)：550-553．

[3]楊龍海，葉波，魏星，等．最新國際肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[J]．中國醫(yī)刊，2016，51(9)：22-25．

[4]張新宇，王紹清．叉頭盒蛋白M1和基質(zhì)金屬蛋白酶-2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義[J]．中國老年學(xué)雜志，2014(11)：2922-2924．

[5]李雯，常穎，李星，等．基質(zhì)金屬蛋白酶降解胞外基質(zhì)致未足月胎膜早破研究進(jìn)展[J]．國際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2016，43(1)：8-10．

[6]莊培濤．基質(zhì)金屬蛋白家族中明膠酶在原發(fā)性肝癌診斷與治療中的研究進(jìn)展[J]．臨床普外科電子雜志，2015，3(2)：49-54．

[7]張衛(wèi)強，林華，周勇安，等．基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J]．中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2006，16(6)：833-835,839．

[8]舒筱燦，王喜梅，王蕾．基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物與腫瘤轉(zhuǎn)移研究進(jìn)展[J]．醫(yī)學(xué)研究雜志，2009，38(11)：113-114．

[9]房學(xué)迅，楊金剛，史秀娟．來源于天然產(chǎn)物的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)抑制劑[J]．化學(xué)進(jìn)展，2007，19(12)：1991-1998．

[10]高鋒，馮一中．COX-2、MMP-9和CD31在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)及其意義[J]．江蘇醫(yī)藥，2014，40(9)：1067-1070．

[11]劉芳，諸蘭艷．脂聯(lián)素在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其與基質(zhì)金屬蛋白酶-9和腫瘤血管生成的關(guān)系[J]．中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2015，40(6)：579-584．

[12]梁乃超，萬曉年．基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9、TIMP-1及VEGF的表達(dá)情況與非小細(xì)胞肺癌組織侵襲的相關(guān)性[J]．昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016，37(10)：67-70．

[13]余雪君，劉欣艷，李彩榮，等．血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義[J]．中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2017，14(8)：107-110．

[14]王鑫，邢國宏．核心蛋白聚糖、基質(zhì)金屬蛋白酶-2在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)及其與臨床特征的關(guān)系[J]．臨床內(nèi)科雜志，2015，32(1)：20-22．

[15]羅磊，王永坤，李世康．香芹酚誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌1299細(xì)胞凋亡的實驗研究[J]．天津醫(yī)藥，2016，44(12)：1418-1422．