PD-L1在乳腺癌中的表達(dá)及其與細(xì)胞免疫的相關(guān)性分析

王立東，徐衛(wèi)國，楊 鑫，李蕊潔，諶娜娜，郭紅輝，趙躍鵬

(1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科，河北唐山063009；2.遷安市人民醫(yī)院腫瘤放化療科，河北遷安 064400；3.遷安市人民醫(yī)院病理科，河北遷安 064400；4.承德縣醫(yī)院外科，河北承德 067400)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。研究證實(shí)，乳腺癌的生物學(xué)行為具有高淋巴管侵襲性，轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，盡管經(jīng)過規(guī)范的治療,但仍然有相當(dāng)部分乳腺癌患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約52.2萬人死于乳腺癌[1]。因此研究乳腺癌中與復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移相關(guān)，影響患者腫瘤微環(huán)境的異常信號通路，可能為乳腺癌的臨床治療提供新的靶點(diǎn)。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測乳腺腫瘤組織中程序性死亡受體1(PD-L1)蛋白的表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測患者外周血清淋巴細(xì)胞亞群水平，探討PD-L1蛋白與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性，并分析PD-L1蛋白表達(dá)水平與乳腺癌患者細(xì)胞免疫的相關(guān)性，旨在為乳腺癌的臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2010年9月至2016年9月于遷安市人民醫(yī)院行手術(shù)治療且臨床資料完整的114例乳腺癌患者病理標(biāo)本，均為女性患者，年齡為33～78歲，中位年齡51歲，組織學(xué)類型均為浸潤性導(dǎo)管癌，術(shù)前均未行放療、化療或內(nèi)分泌治療。乳腺癌病理標(biāo)本根據(jù)第7版國際抗癌聯(lián)盟(UICC)乳腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分期。根據(jù)術(shù)后免疫組織化學(xué)結(jié)果，雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)表達(dá)大于10%，即認(rèn)為陽性；當(dāng)人類表皮生長因子受體2(Her-2)為3+時(shí)認(rèn)定為陽性，0～1+認(rèn)定為陰性，2+時(shí)需結(jié)合FISH檢測結(jié)果，如存在基因拷貝數(shù)擴(kuò)增認(rèn)定為陽性，反之則為陰性；選擇Ki67陽性指數(shù)14%作為其表達(dá)水平高低的界定點(diǎn)，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示Ki67≥14%判定為Ki67高表達(dá)，<14%認(rèn)定為Ki67低表達(dá)[2]；組織學(xué)分級：應(yīng)用Bloom-Richardson分級法將乳腺癌組織標(biāo)本分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級。本研究通過該院倫理委員會審批?；颊呒凹覍倬炇鹬橥鈺?。

1.2方法

1.2.1主要儀器和試劑 石蠟切片機(jī)購自德國Leica公司；倒置光學(xué)顯微鏡購自日本Nikon公司；病理標(biāo)本微波處理儀購自意大利MILESTON公司，4 ℃冰箱購自美的冰箱廠，鼠抗人PD-L1單克隆抗體購自Proteintech公司；檸檬酸鈉-EDTA抗原修復(fù)液、5%牛血清清蛋白(BSA)封閉液、二抗、鏈霉素親和素-生物素-過氧化物酶(SABC)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑、蘇木素購自MDL公司。

1.2.2免疫組織化學(xué)方法 乳腺癌組織石蠟塊連續(xù)切片，每片2.5 μm，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%雙氧水室溫下浸泡切片10 min，檸檬酸鈉-EDTA抗原修復(fù)液抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后使用5%BSA封閉液封閉組織，一抗(鼠抗人PD-L1單克隆抗體1∶100)孵育4 ℃過夜。PBS清洗后孵育二抗37 ℃，30 min。滴加SABC試劑孵育30 min，DAB顯色，蘇木素-伊紅(HE)復(fù)染，梯度乙醇脫水，樹膠封片觀察，隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野。

1.2.3染色結(jié)果評定 細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜棕褐色為PD-L1陽性表現(xiàn)，染色結(jié)果按照每張切片陽性細(xì)胞比例及著色深淺計(jì)分，行半定量分析。根據(jù)每個(gè)視野陽性細(xì)胞率及著色強(qiáng)度進(jìn)行分級計(jì)分，然后根據(jù)兩項(xiàng)之積平均數(shù)判定其陽性強(qiáng)度。染色強(qiáng)度評分：無色判定為0分，淡黃色判定為1分，棕黃色判定為2分，棕褐色判定為3分；再按陽性細(xì)胞百分率評分；陽性細(xì)胞小于5%為0分，5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積小于或等于1為陰性,大于1為陽性[3]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。非正態(tài)分布計(jì)量資料用M(P25，P75)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。單因素分析采用Fisher確切概率法。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PD-L1陽性表達(dá)時(shí)，組織細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)呈均勻染色狀態(tài)，為棕褐色，見圖1。在114例乳腺癌組織中，35例PD-L1蛋白陽性表達(dá)，陽性率為30.7%。

A:陰性表達(dá) (HE×100)；B：陰性表達(dá)(HE×400)；C：陽性表達(dá)(HE×100)；D：陽性表達(dá) (HE×400)。

圖1乳腺癌組織中PD-L1的表達(dá)

2.2PD-L1表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 PD-L1表達(dá)與腫瘤大小(T分期)、Ki-67表達(dá)水平、組織學(xué)分級相關(guān)(P<0.05)。與年齡、淋巴結(jié)狀態(tài)、ER、PR、Her-2表達(dá)水平無相關(guān)性(P>0.05)。PD-L1主要表達(dá)于腫瘤較大、分級高、Ki-67高表達(dá)的患者，見表1。

2.3PD-L1陽性表達(dá)與PD-L1陰性表達(dá)患者淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)的比較 經(jīng)兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)，PD-L1陰性表達(dá)患者CD3+、CD3+CD4+、CD3-CD16+CD56+細(xì)胞的水平高于PD-L1陽性表達(dá)患者(Z=10.705、9.135、7.563；P=0.009、0.016、0.024)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表2。

表1 PD-L1 的表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系(n)

表2 PD-L1陽性表達(dá)與PD-L1陰性表達(dá)患者淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)的比較[M(P25，P75)]

3 討 論

PD-1是CD28/CTLA-4共刺激受體家族中的一員，與其配體PD-L1相互作用向T細(xì)胞傳遞一個(gè)抑制信號從而在腫瘤部位產(chǎn)生免疫抑制的腫瘤微環(huán)境[4]。腫瘤細(xì)胞可異常上調(diào) PD-1及PD-L1的表達(dá)，抑制 T 細(xì)胞的免疫活性，造成腫瘤免疫逃逸，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展[5]。PD-L1不僅表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞(APC)和樹突狀細(xì)胞，也表達(dá)于活化的單核細(xì)胞和B細(xì)胞，不同器官的非淋巴組織[6]。研究表明，PD-L1 亦表達(dá)于人類多種腫瘤細(xì)胞表面，例如肺癌、腎癌、黑色素瘤、乳腺癌等，抑制T細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)其凋亡，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[7]。

本研究納入114例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者，免疫組織化學(xué)法檢測乳腺癌組織中PD-L1蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示PD-L1表達(dá)于乳腺癌組織的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，染色均勻，著色明顯，共35例PD-L1陽性表達(dá)，陽性率為30.7%。區(qū)燕華等[8]用免疫組織化學(xué)方法檢測了154 例乳腺癌組織中PD-L1 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示其陽性表達(dá)率為22.7%，與本課題研究結(jié)果相近。耿衛(wèi)樸[9]研究了40例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中PD-L1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PD-L1陽性表達(dá)率為45%，與本課題研究結(jié)果有一定差別。本研究采用Fisher確切概率法分析PD-L1與臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示PD-L1表達(dá)與腫瘤大小、組織學(xué)分級、Ki-67的表達(dá)情況相關(guān)(P<0.05)，與ER、PR、Her-2、淋巴結(jié)狀態(tài)無明顯關(guān)聯(lián)性。PD-L1主要表達(dá)于腫瘤大于5 cm、Ki-67高表達(dá)及高組織學(xué)分級患者中，與QIN等[10]報(bào)道的結(jié)果相似，提示PD-L1的表達(dá)與更差的病理學(xué)特征相關(guān)。本研究采用獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)對PD-L1陽性表達(dá)組與PD-L1陰性表達(dá)組患者淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示PD-L1陰性表達(dá)組患者CD3+、CD3+CD4+、CD3-CD16+CD56+細(xì)胞的水平高于PD-L1陽性表達(dá)組患者，兩組CD3+CD8+、CD3-CD19+、CD4+/CD8+的細(xì)胞表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而以上標(biāo)記細(xì)胞亞群所代表的功能分別為：CD3+與人體T細(xì)胞免疫相關(guān)，其降低提示著機(jī)體免疫功能低下；CD3+CD4+和CD3+CD8+代表著輔助/誘導(dǎo)型T細(xì)胞和抑制/細(xì)胞毒性T細(xì)胞，其升高與降低與總T細(xì)胞相似；CD3-CD19+細(xì)胞水平的高低可反映機(jī)體細(xì)胞免疫的狀態(tài)；CD3-CD16+CD56+細(xì)胞的水平則反映機(jī)體內(nèi)NK細(xì)胞的活性，其可見于某些腫瘤細(xì)胞及病毒感染的細(xì)胞毒性作用；CD4+/CD8+比值的異常提示患者機(jī)體免疫功能處于失衡狀態(tài)。本研究的結(jié)果提示，PD-L1的高表達(dá)可以惡化乳腺癌患者自身的細(xì)胞免疫，其機(jī)制可能與PD-L1相關(guān)通路抑制患者機(jī)體細(xì)胞免疫相關(guān)。

腫瘤的免疫治療已然成為一種治療腫瘤的重要方式。得益于癌細(xì)胞對常規(guī)治療較敏感，使得部分乳腺癌患者的生存時(shí)間較其他惡性腫瘤患者更長，但復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌目前尚不可治愈，現(xiàn)有治療手段終將會對這部分患者失效。這些腫瘤患者有可能在現(xiàn)有治療方法全部失敗后再次獲益于抗PD-1/PD-Ls治療，使其生存期進(jìn)一步延長。本研究采用免疫組織化學(xué)法，以乳腺癌組織中PD-L1蛋白的表達(dá)情況為切入點(diǎn)，探討PD-L1蛋白與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性，并分析PD-L1 蛋白表達(dá)水平與乳腺癌患者細(xì)胞免疫的相關(guān)性，結(jié)果顯示PD-L1的表達(dá)與乳腺癌更差的臨床病理特征密切相關(guān)，PD-L1的表達(dá)可以提示患者細(xì)胞免疫功能的下降。

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