MAGE-A9在結直腸癌中的表達及臨床意義*

陳建平，陳 茜，施秀英，關 茜，孔 俊，張 曙，朱慧君，王旭東△

(1.南通大學附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇南通 226001；2.南通大學公共衛(wèi)生學院醫(yī)學檢驗系，江蘇南通 226019；3.南通大學附屬醫(yī)院病理科，江蘇南通 226001)

結直腸癌(colorectal cancer, CRC)是一種全球最常見的消化道惡性腫瘤，是世界第3高發(fā)惡性腫瘤，其病死率居惡性腫瘤第4位[1]。在過去的幾十年里，盡管各種檢測方法、新型外科技術、輔助療法及靶向生物療法等技術迅猛發(fā)展使得CRC患者的5年生存率有所提高，但是CRC患者總體生存率仍然較低[2]。因此，深入研究CRC發(fā)生、發(fā)展的相關基因，尋找CRC早期診斷及治療的有效生物靶點，不僅具有重要的研究價值，而且具有巨大的臨床應用前景。黑色素瘤相關抗原家族(melanoma-associated antigen，MAGE)首先從黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)，是一組腫瘤相關抗原[3]，目前已經發(fā)現(xiàn)了60多個成員。MAGE-A是MAGE的亞家族，MAGE-A基因在多種腫瘤異常表達[4]。MAGE-A9是新近被發(fā)現(xiàn)的MAGE-A家族的成員，研究發(fā)現(xiàn)其在黑色素瘤、喉癌、非小細胞肺癌、多發(fā)性骨髓瘤及肝癌中異常表達，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[5-6]。但是，目前有關MAGE-A9在CRC組織中的表達及其臨床意義的相關報道較少。本研究擬觀察MAGE-A9在CRC組織及相鄰癌旁組織中的表達變化，以及其與患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 以2006年1月至2008年12月在南通大學附屬醫(yī)院行手術治療、臨床資料完整且保留蠟塊的203例CRC患者為研究對象，男130例，女73例；年齡45～83歲(中位年齡64.1歲)。所有CRC患者在手術前均未經相關抗腫瘤治療，如放療、化療或手術前免疫治療等，并排除死于術后并發(fā)癥的患者。所有標本診斷標準、組織學類型和臨床分期按照2003版WHO腫瘤組織學分類標準及美國癌癥聯(lián)合委員會和國際抗癌聯(lián)盟分期系統(tǒng)分別進行病理分類及TNM分期[7-8]。每份組織標本由該院兩名病理學醫(yī)師進行病理診斷。本次研究所有患者均簽署知情同意書，并經過該院人類研究倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR測定 MAGE-A9 mRNA表達通過實時定量聚合酶鏈反應分析(qRT-PCR)進行測定。選取23例新鮮CRC及相應癌旁正常組織標本，TRIZOL(美國Life Techologies公司)提取RNA。按試劑盒說明書進行逆轉錄為cDNA，后進行PCR擴增。PCR反應條件如下：95 ℃預變性3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，反應40個循環(huán)。以GAPDH作為內參，比較癌組織及癌旁組織MAGE-A9基因相對表達量。GAPDH引物如下：5′-CAA TGA CCC CTT CAT TGA CC-3′(上游引物)和5′-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3′(下游引物)，202 bp。MAGE-A9基因特異性引物如下：5′-CAC TGT ATG TCA TCT CTG-3′(上游引物)和5′-ACT ACT GTC ATT CAT TAA CT-3′(下游引物)，280 bp。試驗重復3次，取平均值進行分析。

1.2.2免疫組織化學染色 本研究采用EnVision 二步法進行免疫組織化學染色分析，試劑盒選購于北京中杉金橋生物技術有限公司。嚴格按照操作說明書進行石蠟切片中MAGE-A9蛋白檢測。MAGE-A9兔抗人單克隆抗體購自美國San Diego公司，生物素化山羊抗兔二抗和辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素(三抗)為試劑盒中的原液。顯色液進行免疫組織化學顯色，不定時在顯微鏡下觀察顯色程度；蘇木素復染，梯度乙醇脫水后封片、拍照。陰性對照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。由該院病理科醫(yī)師閱片，每張切片隨機取5個400倍視野。按著色強度評分如下：細胞無著色得0分，細胞著淺黃色得1分，細胞著棕黃色得2分，細胞著棕褐色得3分。 按陽性細胞比例評分如下：陽性細胞百分比0%～10% 得1分，陽性細胞百分比大于10%～50% 得2分，陽性細胞百分比大于50%～80% 得3分，陽性細胞百分比大于80%～100% 得4分。將細胞著色強度和陽性細胞比例的乘積作為MAGE-A9著色分數(shù)結果進行判讀：≥3判為高表達，<3判為低表達[9-10]。

2 結 果

2.1MAGE-A9 mRNA在癌組織及癌旁組織中的表達 MAGE-A9 mRNA在癌組織和癌旁組織中的相對表達水平分別是44.92±8.03 和 3.81±0.93(P<0.05)。MAGE-A9 mRNA在癌組織中的表達是癌旁組織中的11.8倍。

2.2MAGE-A9蛋白在癌組織及癌旁組織中的表達 免疫組織化學結果顯示，MAGE-A9蛋白在癌組織和癌旁組織中的高表達率分別是83.25%(169/203)和15.76%(32/203)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。MAGE-A9蛋白主要定位于CRC細胞的細胞質(圖1)，個別CRC組織標本中MAGE-A9蛋白定位于間質細胞。

2.3MAGE-A9在CRC組織的表達與患者臨床病理參數(shù)的關系 CRC組織中高表達的MAGE-A9與患者腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤浸潤深度和淋巴結轉移有關(P<0.05)，見表1，而與患者年齡、性別、腫瘤位置、組織學類型及術前CEA水平臨床病理參數(shù)無關。另外，有5例病例存在遠處轉移。

A、B、C、D:CRC組織中MAGE-A9呈陽性表達；E、F:MAGE-A9在癌旁組織中呈陰性表達；紅色箭頭：MAGE-A9定位于細胞質；綠色箭頭：MAGE-A9定位于間質細胞；A、C、E：×40；B、D、F：×400

圖1 免疫組織化學法檢測CRC組織和癌旁組織中MAGE-A9蛋白的表達表1 CRC組織中MAGE-A9表達與患者臨床病理特征的關系[n(%)]

續(xù)表1 CRC組織中MAGE-A9表達與患者臨床病理特征的關系[n(%)]

a：混合腺癌(管狀、黏液狀)10 例；黏液癌8例；印戒細胞癌2例；腺鱗癌1例

2.4MAGE-A9的表達與CRC患者預后的關系 基于單因素Cox回歸分析，MAGE-A9表達是CRC患者不良預后的危險因子(P<0.01)，腫瘤部位、腫瘤分化、TNM分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及術前CEA水平均是影響CRC患者預后的相關因素(P<0.01)，見表2。對上述影響患者預后的因素進一步進行多因素Cox風險比例函數(shù)模型分析。結果表明，MAGE-A9表達、腫瘤部位、腫瘤分化、TNM分期和術前CEA水平是影響CRC患者預后的主要因素，見表2。Kaplan-Meier 法生存曲線顯示高表達MAGE-A9組CRC患者的生存時間明顯低于低表達MAGE-A9組(P<0.01)。結腸腫瘤、低分化腫瘤、晚期TNM分期及術前高CEA水平患者的生存時間明顯較短(P<0.01)，見圖2。

圖2 MAGE-A9蛋白不同表達患者的生存曲線圖表2 單因素和多因素分析臨床病理特征對5年生存預后的影響

項目單因素分析nP95%CI多因素分析HRP95%CIMAGE-A9表達<0.016.537～34.7769.005<0.013.766～21.536 高109 低94年齡(歲)0.7360.678～1.735 <6075 ≥60128性別0.1140.408～1.101 男130 女73位置<0.012.044～6.0992.6010.0041.369～4.942 結腸153 直腸50組織學類型0.3500.292～1.547 腺癌182 其他a21分化程度<0.010.195～0.5130.4170.0040.231～0.751 高、中分化169 低分化34TNM分期<0.011.594～3.1282.1110.0191.129～3.948 0～Ⅰ46 Ⅱ80 Ⅲ～Ⅳ77浸潤深度<0.012.673～19.244 Tis+T17 T244 T3+4a152淋巴結轉移<0.011.214～1.785 N0125 N1a38 N1b20 N1c,N2a,2b20術前CEA(ng/mL)<0.011.691～5.2102.5250.0021.392～4.580 >1527 ≤15121

續(xù)表2 單因素和多因素分析臨床病理特征對5年生存預后的影響

a：混合腺癌(管狀、黏液狀)10 例；黏液癌8例；印戒細胞癌2例；腺鱗癌1例

3 討 論

MAGE是從黑色素瘤細胞系中發(fā)現(xiàn)并分離出的腫瘤特異性抗原基因[3]。MAGE基因分為MAGE-Ⅰ和MAGE-Ⅱ兩大亞組[3]。MAGE-A 為MAGE-I的成員之一。MAGE-A1～MAGE-A12是MAGE-A家族的幾個亞型，其中MAGE-A1和MAGE-A3是科學家們研究較為透徹的兩個亞型[4,7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)MAGE-A9在肝癌、食管腺癌、喉鱗狀細胞癌等人類多種腫瘤組織中存在異常表達，并且與惡性腫瘤的侵襲轉移、不良預后密切相關[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)在某些腫瘤中MAGE-A9是進行個性化免疫療法的潛在靶點[8-10]。

在本次研究中，本課題組運用qRT-PCR法及免疫組織化學法分別檢測了MAGE-A9 mRNA和MAGE-A9蛋白在CRC腫瘤組織和相應癌旁組織中的表達差異。結果顯示MAGE-A9 mRNA和蛋白在CRC患者腫瘤組織中的表達均明顯高于癌旁組織。這些發(fā)現(xiàn)表明MAGE-A9在人類腫瘤中的多態(tài)性，預示MAGE-A9可能與腫瘤的發(fā)展和進程有關。

本研究比較分析了MAGE-A9表達與CRC患者臨床病理參數(shù)及臨床預后的關系。分析發(fā)現(xiàn)MAGE-A9高表達提示CRC患者腫瘤低分化、較晚的TNM分期或淋巴結轉移。本次研究中只發(fā)現(xiàn)5例遠處轉移病例，由于樣本量較少，因此沒有評估MAGE-A9和遠處轉移的關系。這些結果表明MAGE-A9可能在CRC的發(fā)生、發(fā)展中起了重要作用。運用Cox比例風險回歸模型進行單因素預后分析表明MAGE-A9表達、腫瘤部位、腫瘤分化、TNM分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及術前CEA水平與CRC患者預后有關。多因素預后分析進一步表明MAGE-A9高表達、腫瘤位置、腫瘤分化、TNM分期和術前CEA水平都是影響CRC患者預后的主要獨立因素。使用Kaplan-Meier法分析顯示，MAGE-A9低表達組CRC患者比MAGE-A9高表達組5年生存率長。這意味著MAGE-A9高表達提示臨床預后差，MAGE-A9的過表達是一個獨立的預后不良的重要標志，并可能成為CRC治療的一個參考指標。因此推斷在結直腸癌患者中，MAGE-A9從腫瘤早期即開始表達增高，在一定程度上起著癌蛋白的作用，其高表達在腫瘤細胞的生存、增殖中發(fā)揮了重要作用。此外，MAGE-A9高表達可能會打破人體內微環(huán)境平衡，在促進腫瘤細胞的增殖和遠處轉移過程中起著重要的作用。其機制需要通過體外細胞實驗研究進行深入探討。

有研究報道在喉鱗狀細胞癌MAGE-A9高表達于細胞質和間質細胞[11]。值得注意的是，本研究中發(fā)現(xiàn)在少數(shù)CRC病例中MAGE-A9表達于間質細胞。這種現(xiàn)象可能需要進一步擴大樣本量深入研究MAGE-A9在間質細胞表達的意義和潛在機制。

綜上所述，本次研究結果顯示CRC組織中MAGE-A9高表達，并與患者預后差密切相關。MAGE-A9可能是CRC診斷、預測CRC患者預后的重要指標，同時可作為CRC的潛在靶點個性化指導治療方案的選擇。

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