槲皮素對人肝星狀細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響與其細(xì)胞周期研究

蔣 煒，鄧治林，李福昌

(四川省簡陽市中醫(yī)醫(yī)院外科 641400)

肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)，也稱肝貯脂細(xì)胞(fat-storing cell，F(xiàn)SC)，主要分布于肝竇周隙。目前認(rèn)為，F(xiàn)SC可以合成和分泌膠原蛋白及產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，在肝纖維化、肝硬化發(fā)展過程中起著主要作用[1-3]。槲皮素(quercetin)屬黃酮類化合物，存在于許多植物的花、葉、果實(shí)中，如洋蔥、蘋果、綠茶、蘆丁、連翹及抗肝病植物藥趕黃草等植物中含量較高。目前認(rèn)為，槲皮素具有較好的祛痰、止咳、平喘、抗腫瘤等作用[4-5]。本研究通過用體外培養(yǎng)人HSC的方法為基礎(chǔ)，用槲皮素進(jìn)行干擾，檢測槲皮素對HSC細(xì)胞周期的影響，以及對其Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響，分析HSC參與肝纖維化的機(jī)制及槲皮素的意義，為星狀細(xì)胞的功能調(diào)控、調(diào)控機(jī)制的研究，及肝纖維化、肝硬化的防治研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來源及主要試劑 人HSC株：廣州市十環(huán)醫(yī)藥科技有限公司；槲皮素：美國Sigma公司，批號PHR1488，相對分子質(zhì)量302.24；量子點(diǎn)標(biāo)記試劑盒：武漢珈源量子點(diǎn)技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司；免疫組織化學(xué)試劑盒：北京博奧森生物技術(shù)有限公司；BX51熒光顯微鏡：日本奧林巴斯(Olympus)公司；Leica-DM6000光學(xué)顯微鏡Leica-DFC295系統(tǒng)：徠卡(Leica)儀器(德國)有限公司；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀：美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組干擾 將購買的細(xì)胞株(廣州市十環(huán)醫(yī)藥科技有限公司)復(fù)蘇，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度約1.0×108/L，接種于24孔培養(yǎng)板(鋪墊圓形蓋玻片)。培養(yǎng)條件為：37 ℃、10%小牛血清、DMEM培養(yǎng)基、5% CO2。取培養(yǎng)第4天作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)細(xì)胞分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。槲皮素以二甲基亞砜為溶劑溶解稀釋，分別給予0 μmol/L(對照組)、50 μmol/L(50-實(shí)驗(yàn)組)、100 μmol/L(100-實(shí)驗(yàn)組)、500 μmol/L(500-實(shí)驗(yàn)組)干擾，48 h后終止干擾。取出蓋玻片，4%甲醛固定30 min，進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2染色及檢測 (1)HE染色：取出細(xì)胞爬片，蘇木精染色，鹽酸乙醇分色，氨水返藍(lán)，伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片。采用盲法將細(xì)胞核體積由大至小分為3類進(jìn)行半定量計(jì)數(shù)。(2)免疫組織化學(xué)染色(SABC法)：細(xì)胞爬后片PBS沖洗，0.1% Triton-X 100處理，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加1∶100稀釋的一抗孵育過夜，PBS洗滌，二抗孵育，PBS洗滌，SABC酶標(biāo)，DAB(棕色)顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片。(3)量子點(diǎn)標(biāo)記[6-8]：細(xì)胞爬片后0.1% Triton-X 100通透處理，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉，滴加1∶100稀釋的Ⅰ膠原蛋白一抗(鼠抗鼠)37 ℃ 4 h，滴加1∶100稀釋的Ⅲ膠原蛋白一抗(兔抗鼠)37 ℃ 4 h，PBS洗滌，量子點(diǎn)標(biāo)記二抗(抗鼠、抗兔)復(fù)合物37 ℃孵育20 min，PBS洗滌，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察成像并照相，記錄觀察結(jié)果。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞成細(xì)胞懸液，離心，冰乙醇固定。離心，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，加入碘化丙啶(PI)染液，孵育。以488 nm氬離子激光激發(fā)，應(yīng)用BD CSCalibur(美國 BD公司)流式細(xì)胞儀FACStation、CellQUEST Pro數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行細(xì)胞周期檢測和分析。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué) 普通光學(xué)顯微鏡觀察培養(yǎng)HSC，各樣本均表現(xiàn)為細(xì)胞密度及細(xì)胞形態(tài)無明顯的差異。細(xì)胞貼壁生長，有突起，細(xì)胞直徑約25～35 μm。核位于中央，體積大，嗜堿性；細(xì)胞質(zhì)呈弱嗜堿性，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見大量細(xì)小嗜堿性細(xì)小顆粒(圖1)。槲皮素干擾48 h，細(xì)胞核大小不均勻，細(xì)胞核越小，嗜堿性越強(qiáng)。HSC經(jīng)HE染色細(xì)胞核計(jì)數(shù)4組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 肝星狀細(xì)胞HE染色細(xì)胞核計(jì)數(shù)(n=100)

2.2免疫組織化學(xué)結(jié)果 各組均可見大量HSC，細(xì)胞內(nèi)均有Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白陽性產(chǎn)物，分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色顆粒(圖1)。圖像分析吸光度值和陽性面積比值(PN-area)結(jié)果所示，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

圖1 HE染色、免疫組織化學(xué)染色HSC(×200) 表2 各組Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白免疫組織化學(xué)染色吸光度與PN-area比較

組別nⅠ型膠原吸光度PN-areaⅢ型膠原吸光度PN-area對照組240.135±0.00427.36±6.470.216±0.11822.15±4.2750-實(shí)驗(yàn)組240.117±0.003a18.29±2.34a0.209±0.09821.69±2.48100-實(shí)驗(yàn)組240.112±0.004a15.48±2.51a0.221±0.12420.46±3.52500-實(shí)驗(yàn)組240.097±0.003a14.69±1.22a0.224±0.04122.36±4.42

a：P<0.05，與對照組比較

圖2 免疫熒光染色結(jié)果(×200)

2.3免疫熒光結(jié)果 干擾48 h后，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白經(jīng)雙標(biāo)顯示，對照組和各實(shí)驗(yàn)組Ⅰ膠原蛋白陽性產(chǎn)物顯示為綠色熒光，Ⅲ膠原蛋白陽性產(chǎn)物顯示為紅色熒光(圖2)。顯微鏡熒光強(qiáng)度定量分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)明顯降低，與對照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)無明顯變化，與對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白免疫染色熒光強(qiáng)度

a：P<0.05，與對照組比較

2.4肝星狀細(xì)胞流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測結(jié)果 干擾48 h后，對照組和實(shí)驗(yàn)組G1期細(xì)胞比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；S期細(xì)胞比例，G2期細(xì)胞比例各組之間比較，無明顯變化規(guī)律(圖3，表4)。

A:對照組；B：50-實(shí)驗(yàn)組；C：100-實(shí)驗(yàn)組；D：500-實(shí)驗(yàn)組

圖3 肝星狀細(xì)胞流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測結(jié)果表4 流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測結(jié)果(%)

a：P<0.05，與對照組比較

3 討 論

肝臟疾病是目前威脅人類健康的一個(gè)巨大問題。臨床上在各種慢性病致病因子的作用下，肝內(nèi)纖維成分異常增生，膠原纖維過度沉淀，引起肝纖維化，繼續(xù)發(fā)展則成為肝硬化。文獻(xiàn)報(bào)道表明，HSC具有產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)及纖維的能力，因此認(rèn)為，HSC與肝纖維化及肝硬化直接相關(guān)[9-11]。本研究采用現(xiàn)有的HSC株培養(yǎng)技術(shù)，用臨床上使用極為廣泛的趕黃草等中藥的提純品槲皮素對細(xì)胞進(jìn)行干擾，在體外實(shí)驗(yàn)對HSC的形態(tài)結(jié)構(gòu)及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的合成功能進(jìn)行初步研究。由于HSC固有的生物特性，其Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白基因會表達(dá)而產(chǎn)生膠原纖維的主要構(gòu)成成分：Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白。通過檢測培養(yǎng)HSC形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，反應(yīng)HSC的功能狀態(tài)和產(chǎn)生膠原纖維的能力，為肝纖維化、肝硬化的基礎(chǔ)研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，體外肝星狀細(xì)胞呈貼壁生長，有多個(gè)突起，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見大量嗜堿性細(xì)小顆粒。細(xì)胞核體積統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，槲皮素干擾后，大細(xì)胞核的細(xì)胞比例減少，小細(xì)胞核的細(xì)胞比例增高。細(xì)胞核大小及嗜堿性可以一定程度反應(yīng)細(xì)胞的功能狀態(tài)，一般細(xì)胞核體積越小，嗜堿性越強(qiáng)，說明細(xì)胞的活性程度越低，功能相對靜止，反之亦然。結(jié)果說明，槲皮素對肝星狀細(xì)胞的活性有抑制作用。

免疫組織化學(xué)及免疫熒光檢測顯示，肝星狀細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)下細(xì)胞內(nèi)均有Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白陽性產(chǎn)物，陽性產(chǎn)物分布在細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，免疫組織化學(xué)切片中表現(xiàn)出呈棕黃色顆粒。熒光顯微鏡下，免疫產(chǎn)物呈現(xiàn)熒光，通過采用不同種屬一抗分別標(biāo)記，在同樣的細(xì)胞內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白呈現(xiàn)出不同的綠色熒光和紅色熒光。用中藥有效成分提純品槲皮素進(jìn)行培養(yǎng)干擾后，細(xì)胞內(nèi)仍然有Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)，但Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)強(qiáng)度明顯降低，Ⅲ型膠原表達(dá)強(qiáng)度未見明顯改變。說明槲皮素對體外培養(yǎng)HSC Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白具有調(diào)節(jié)作用。

有研究也證實(shí)，血清Ⅲ型膠原蛋白濃度與肝炎癥、壞死和肝纖維化有關(guān)，但以肝纖維化相關(guān)為主，肝硬化患者明顯升高，但肝硬化晚期，Ⅲ型膠原蛋白反而低于早期[12-13]。膠原纖維中以Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白為主，在炎癥及損傷修復(fù)過程中，伴隨著舊膠原的降解和新膠原的產(chǎn)生、重新排列沉積。在胚胎皮膚損傷修復(fù)中有無瘢痕愈合現(xiàn)象[14]，無瘢痕愈合以Ⅲ型膠原蛋白為主，無瘢痕愈合可能與細(xì)胞外基質(zhì)的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白比例有直接關(guān)系，即：Ⅲ型膠原蛋白濃度高相對Ⅰ型膠原蛋白濃度高更容易降解，相對更不容易形成瘢痕組織及膠原纖維沉積。在肝纖維化及肝硬化的發(fā)展中，其實(shí)本質(zhì)就是炎癥導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，HSC受刺激產(chǎn)生膠原纖維，膠原纖維不能充分降解，從而導(dǎo)致膠原纖維沉積的過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，槲皮素可以降低Ⅰ型膠原蛋白的產(chǎn)生，說明其可以抑制星狀細(xì)胞產(chǎn)生膠原纖維沉積；另外，槲皮素對Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)強(qiáng)度未見明顯影響，說明槲皮素可以降低Ⅰ型膠原蛋白與Ⅲ型膠原蛋白的比例，可以使其產(chǎn)生的膠原更容易降解，可能是趕黃草等中藥可以抑制肝纖維化、肝硬化的發(fā)展速度、甚至緩解肝纖維化及肝硬化的主要機(jī)制。

流式細(xì)胞儀是檢測細(xì)胞周期的經(jīng)典方法。實(shí)驗(yàn)中，肝星狀細(xì)胞保持不斷增殖狀態(tài)，細(xì)胞總是處于從G1、S、G2和M期的連續(xù)的細(xì)胞周期中。在細(xì)胞周期的各階段，細(xì)胞分別進(jìn)行著DNA復(fù)制、蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞分裂等重要的生理活動(dòng)[12，15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，槲皮素有明顯升高G1期星狀細(xì)胞比例的作用，對照組和實(shí)驗(yàn)組G1期細(xì)胞比例比較有明顯差異，而S期、G2期細(xì)胞比例無明顯影響。其結(jié)果說明，槲皮素對星狀細(xì)胞的增殖具有抑制作用，在細(xì)胞周期中，其抑制作用的時(shí)間點(diǎn)G1期。其G1比例增高，則說明細(xì)胞在G1停留時(shí)間延長、細(xì)胞向G0發(fā)展的可能性增大、細(xì)胞出現(xiàn)功能相對停滯的可能性增大，則出現(xiàn)而不被活化的可能性增大，這可能是趕黃草等含槲皮素的中藥可以抑制肝纖維化、肝硬化的發(fā)展的作用機(jī)制之一[16]。

綜上所述槲皮素對體外培養(yǎng)HSC有明顯調(diào)控作用，可以抑制Ⅰ型膠原蛋白的合成，改變Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的比例。同時(shí)，槲皮素可以延長肝星狀細(xì)胞G1期，從而影響細(xì)胞的增殖及活性，可能是趕黃草等富含槲皮素的中藥可以達(dá)到臨床控制肝纖維化、肝硬化的發(fā)展的作用機(jī)制之一。但中藥的作用機(jī)制研究極為復(fù)雜，關(guān)于槲皮素對肝臟疾病的作用機(jī)制研究需大量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究進(jìn)行進(jìn)一步深入的研究和探討。

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