白藜蘆醇后處理通過PI3K/Akt/Nfr2上調(diào)HO-1對(duì)大鼠心肌I/R的保護(hù)研究

鄧 穎，張 雄，胡 紅

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院第一分院心內(nèi)科 400011；2.重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心 400016；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院第一分院腎內(nèi)科 400011)

缺血性心血管疾病是臨床上常見病、多發(fā)病。心肌組織缺血后，會(huì)發(fā)生一定程度的損傷，而當(dāng)心肌組織恢復(fù)血流灌注時(shí)，心肌組織受損反而加重，甚至可能發(fā)生不可逆的損傷，加重心肌細(xì)胞的死亡，這就是所謂的缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion,I/R)。白藜蘆醇是一種廣泛存在于植物中的多酚類化合物，具有廣泛的生物活性，主要表現(xiàn)為：抗炎[1]、抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抗血栓形成[4]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[5]等。隨著對(duì)白藜蘆醇不斷研究，其對(duì)心、腦、肝、腎等器官和組織發(fā)生IR時(shí)都具有保護(hù)作用[6-9]。很多研究已經(jīng)證實(shí)，白藜蘆醇對(duì)IR的心肌保護(hù)作用十分明確，但其機(jī)制不清[10-11]，這成為其開發(fā)和臨床應(yīng)用的瓶頸。本實(shí)驗(yàn)擬通過建立大鼠心肌I/R損傷模型，觀察白藜蘆醇后處理對(duì)I/R損傷的心肌的保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級(jí)SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量200～300 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)開始前將大鼠置于室溫恒定(20～25 ℃)的實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)7～10 d，給予充足的普通飼料和水，飲食自由攝取。造模手術(shù)開始前禁食12 h，自由飲水。

表1 各組SD大鼠血漿和心肌組織中MDA和SOD水平比較

a：P<0.05，與假手術(shù)組比較；b：P<0.05，與I/R組比較；c：P<0.05，與I/R+Res組比較

1.2主要試劑 白藜蘆醇購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；LY294002購(gòu)置Santa Cruz公司；血紅素加氧酶(HO)-1檢測(cè)試劑盒購(gòu)置武漢博士德公司；超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒、蛋白提取試劑盒、濃度檢測(cè)試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠配置試劑盒等均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；MDA測(cè)定試劑盒購(gòu)置南京凱基科技生物有限公司；鼠多抗PI3K、Akt(p-Akt)、核因子相關(guān)因子2(Nrf2)、HO-1抗體購(gòu)置Bioworld公司；內(nèi)參兔抗β-actin和HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)自博鰲森生物技術(shù)有限公司；PVDF膜和ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自Bio-rad公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物分組和模型建立 將所有SD大鼠分為4組：假手術(shù)組、I/R組、I/R+白藜蘆醇處理(I/R+Res)組及I/R+Res+LY294002處理(I/R+Res+LY)組。3.5%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，成功后，取仰臥位固定，打開胸腔，暴露心臟剪開心包膜，于左冠狀動(dòng)脈前降支根部穿線結(jié)扎，觀察心電圖出現(xiàn)ST段立即圖太高，而心肌顏色由紅色變成白色，即為成功。然后以生理鹽水浸泡的紗布覆蓋，持續(xù)30 min后剪開結(jié)扎線，血流立即恢復(fù)，心肌由灰白色變成紅色，心電圖顯示ST段有50%以上的回落，即為再灌注成功。假手術(shù)組大鼠僅開胸并找到左冠狀動(dòng)脈前降支根部，穿線但不結(jié)扎；I/R+Res組或者是I/R+Res+LY組，于再灌注前1 min由舌下靜脈推注白藜蘆醇(20 mg/kg)或LY294002 (5 mg/kg)。

1.3.2SOD活性和MDA水平測(cè)定 各組SD大鼠于I/R結(jié)束后，分別收集靜脈血和心肌組織，前者直接離心分離得到血漿，后者研磨后加入裂解液并離心得到上清液，然后按照試劑盒說明書操作步驟測(cè)定SOD活性(黃嘌呤氧化酶法)和MDA水平(硫代巴比妥法)。

1.3.3HO-1酶活性測(cè)定 取部分左室前間壁缺血心肌加入蔗糖-Tris緩沖液制成10%組織勻漿，高速離心分離微粒體， 考馬亮蘭法定量蛋白濃度；再根據(jù)HO-1降解血紅素生成膽紅素的原理，通過測(cè)定反應(yīng)體系中膽紅素的生成量代表HO-1活性，單位為nmol·mg-1·h-1。

1.3.4Western blot 收集各組SD大鼠心尖組織，加入1 mL RIPA蛋白裂解液，充分裂解后于4 ℃，13 000 r/min離心15 min后，用Bradford法測(cè)定每組蛋白樣品濃度并分裝保存。配置8%～10%的PAGE膠，上樣50 μg經(jīng)SDS-PAGE電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后置入TBST稀釋的1∶100的PI3K、Akt(p-Akt)、Nfr2、HO-1和β-actin抗體4 ℃孵育過夜；充分洗滌后加入1∶5 000的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，最后用ECL發(fā)光試劑盒行曝光顯影，經(jīng)Bio-rad Chemical Dox XRS凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶的分析。各目的蛋白與β-actin條帶的灰度值的比值為各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。重復(fù)試驗(yàn)3次。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血漿和心肌組織中MDA和SOD水平比較 與假手術(shù)組比較，I/R組，大鼠血漿和心肌組織中的MDA水平明顯升高而SOD活力水平卻明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；I/R+Res組大鼠血漿和心肌組織中MDA水平明降低，而SOD水平明顯升高，與I/R組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；I/R+Res+LY組，MDA水平有所升高，SOD水平卻有所降低，與I/R+Res組比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2各組大鼠血漿和心肌組織中HO-1活性比較 與假手術(shù)組比較，I/R組術(shù)后，大鼠血漿和心肌組織中的HO-1的活性有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；I/R+Res組大鼠血漿和心肌組織中HO-1的活性明顯升高，較單純的I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；I/R+Res+LY組，HO-1活性卻有所降低，與I/R+Res組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠血漿和心肌組織中HO-1 活性比較

a：P<0.01，與I/R組比較；b：P<0.01，與I/R+Res組比較

2.3各組大鼠心肌組織中PI3K、Akt(p-Akt)、Nrf2和HO-1蛋白水平表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，I/R組大鼠心肌組織中的PI3K、p-Akt、Nrf2和HO-1表達(dá)升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；I/R+Res組大鼠心肌組織中PI3K、p-Akt、Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)明顯升高，且與I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；I/R+Res+LY組，PI3K、p-Akt、Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)水平降低，與I/R+Res組比較，差異也極有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

A:Western blot;B:蛋白表達(dá)水平；1：假手術(shù)組；2：I/R組；3：I/R+Res組；4：I/R+Res+LY組；a：P<0.01，與I/R組比較；b：P<0.05，與 I/R+Res組比較

圖1各組大鼠心肌組織中PI3K、Akt、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)比較

3 討 論

I/R損傷發(fā)生的機(jī)制不清，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與氧自由基的大量產(chǎn)生和堆積密切相關(guān)，即缺血導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，并且降低了清除自由基的抗氧化酶類的合成能力，進(jìn)一步加重自由基對(duì)再灌注組織的損傷。MDA是心肌細(xì)胞受損時(shí)脂質(zhì)過氧化的反應(yīng)產(chǎn)物，是一種氧自由基，它的濃度大小可較好地反映心肌I/R后心肌組織的脂質(zhì)過氧化程度，與心肌的受損程度呈正比。SOD是重要的抗氧化劑，能夠清除自由基而起保護(hù)細(xì)胞的作用。本實(shí)驗(yàn)以結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支30 min，然后再灌注2 h的方法構(gòu)建大鼠心肌I/R模型，模型的心肌組織和血漿中的MDA水平均明顯增高，且心肌組織和血漿中的SOD水平明顯降低，證實(shí)了I/R導(dǎo)致氧自由基的增多和抗氧化能力的下降。本實(shí)驗(yàn)給予白藜蘆醇處理后，心肌組織和血漿中的MDA水平較I/R組降低，且心肌和血漿中的SOD水平增高，提示白藜蘆醇能降低I/R損傷導(dǎo)致的氧自由基的堆積和提高抗氧化能力，推測(cè)最終可減輕了因缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激損傷。

HO是血紅素分解代謝過程中的起始酶和限速酶，其生物功能是使細(xì)胞內(nèi)的血紅素降解生產(chǎn)膽紅素、CO等，這些物質(zhì)具有強(qiáng)烈的抗氧化、抗凋亡和抗炎等作用，是細(xì)胞內(nèi)重要的內(nèi)源性保護(hù)體系[12]。HO有3種類型，其中HO-1，不僅在機(jī)體生理狀態(tài)下發(fā)揮作用，更重要的是在缺血、缺氧、I/R等應(yīng)激狀態(tài)下能被誘導(dǎo)產(chǎn)生，對(duì)抗氧化應(yīng)激，保護(hù)組織細(xì)胞免遭損傷。本研究結(jié)果顯示，I/R術(shù)后，心肌組織中HO-1的酶活性和蛋白水平的表達(dá)略有升高；給予白藜蘆醇處理后，HO-1的活性和蛋白表達(dá)都有了顯著提高，這說明白藜蘆醇可通過激活HO-1活性和增進(jìn)其表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮其抗氧化作用(清除氧自由基和減少過氧化物的產(chǎn)生)，從而保護(hù)受損的心肌細(xì)胞，這與REN等[13]報(bào)道的白藜蘆醇可通過激活HO-1的活性發(fā)揮腦缺血再灌注損傷的腦保護(hù)作用基本一致[13]。PI3K/Akt通路是一條經(jīng)典的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，涉及了細(xì)胞周期的調(diào)控、凋亡的啟動(dòng)、血管生成、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過程。多項(xiàng)研究結(jié)果均顯示PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路在心肌缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮著重要作用，且很多植物提取物可通過上調(diào)PI3K/Akt通路發(fā)揮保護(hù)心肌的作用[14-16]。有研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇預(yù)適應(yīng)能通過上調(diào)PI3K/Akt通路，抑制心肌細(xì)胞的凋亡，從而減少心肌梗死面積，改善心肌功能[17]。

HO-1是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，是PI3K/Akt/Nrf2通路的下游元件。多項(xiàng)研究結(jié)果均顯示PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路在心肌I/R過程中發(fā)揮著重要作用。PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路被激活后，其下游有眾多轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其中與抗氧化作用聯(lián)系最為緊密的一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子就是Nrf2。正常情況下Nrf2是以無活性狀態(tài)位于細(xì)胞質(zhì)中，其活性因與細(xì)胞質(zhì)中的一種伴侶蛋白Keap1結(jié)合而被抑制。一旦細(xì)胞處于強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，Keap1與Nrf2發(fā)生解離，進(jìn)而喪失了抑制Nrf2活性的能力，此時(shí)Nrf2易位進(jìn)入細(xì)胞核中，與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，促進(jìn)HO-1等多種抗氧化蛋白的表達(dá)[18-19]。本實(shí)驗(yàn)還對(duì)各組心肌組織中PI3K、Akt(p-Akt)、Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，I/R術(shù)后，心肌組織中的PI3K、p-Akt、Nrf2和HO-1的表達(dá)略有升高；與I/R組相比，白藜蘆醇后適應(yīng)能夠明顯升高PI3K、p-Akt和Nrf2的表達(dá)，而這些作用可被PI3K/Akt通路的抑制劑LY294002所逆轉(zhuǎn)。因此，本研究認(rèn)為，白藜蘆醇可能通過激活PI3K/Akt/Nrf2通路而激活HO-1的活性，進(jìn)而發(fā)揮其抗氧化作用保護(hù)受損心肌的作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明白藜蘆醇后適應(yīng)對(duì)I/R的心肌有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是白藜蘆醇通過激活PI3K/Akt/Nrf-2/HO-1信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮其抗氧化應(yīng)作用，本實(shí)驗(yàn)將為臨床上應(yīng)用白藜蘆醇減輕和防治心肌I/R提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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