17β-雌二醇對大鼠神經(jīng)病理性疼痛閾值的影響*

鄧 超，顧雅娟，張 軍

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，新疆石河子 832000)

疼痛閾值具有性別差異[1]，雌激素受體分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中許多與痛覺有關(guān)的區(qū)域，可在多水平上影響疼痛的產(chǎn)生和傳遞[2]，N-甲基-D-天冬氨酸受體1(N-methyl-D-aspartic acid receptor 1,NMDAR1)為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸受體的一種亞型，廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中,并參與各種疼痛的產(chǎn)生、傳導(dǎo)和維持，尤其在神經(jīng)病理疼痛中的傷害性信息傳遞和調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮了主要作用[3-4]，但雌激素在調(diào)節(jié)神經(jīng)病理性疼痛中所起的作用還不十分清楚。本研究對坐骨神經(jīng)慢性壓榨損傷(chronic constriction injury of the sciatic nerve,CCI)大鼠模型進(jìn)行研究，探討17β-雌二醇對神經(jīng)病理性大鼠疼痛閾值的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 本實驗已經(jīng)醫(yī)院動物管理倫理委員會同意，選用3個月齡健康，清潔級SD雌性大鼠體質(zhì)量250 g左右，由新疆維吾爾自治區(qū)疾病控制中心提供，動物合格證編號：SYXK(新) 2016-0002。熱刺激實驗反應(yīng)5～30 s的大鼠被留用，反應(yīng)異常大鼠被剔除，實驗室溫度20～22 ℃，濕度50%～60%，光照時間8：00-20：00，給予同樣標(biāo)準(zhǔn)的飲食，安靜環(huán)境，分籠飼養(yǎng)1周，在異氟烷麻醉下，從脊柱兩側(cè)肋下，切口入腹行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，休息5 周。

1.2方法

1.2.1動物模型制備與分組

1.2.1.1CCI動物模型的建立 按照Bennett 等的方法構(gòu)建CCI動物模型[5]。手術(shù)主要步驟如下：異氟烷吸入麻醉下，固定大鼠于手術(shù)臺，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾。暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)，在接近其分叉之前游離出約7 mm的神經(jīng)，用3根4-0的鉻腸線間隔1 mm進(jìn)行結(jié)扎，要求僅留下縊痕而不阻斷神經(jīng)血供，逐層縫合肌肉和皮膚，經(jīng)肌內(nèi)注射40萬U青霉素預(yù)防感染，待大鼠清醒后分籠飼養(yǎng)。

1.2.1.2實驗分組與處理 大鼠采用隨機數(shù)字表法分5組(每組10只)。假手術(shù)組、CCI組、雌二醇組、拮抗劑組、復(fù)合組。假手術(shù)組：分離暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)但不結(jié)扎，以等容量生理鹽水頸后皮下注射； CCI組：制備CCI動物模型后，以等容量生理鹽水頸后皮下注射。 雌二醇組：制備CCI動物模型后，頸后皮下注射17β-雌二醇(2 μL/d,Sigma 公司,美國)。拮抗劑組：制備CCI動物模型后，頸后皮下注射NMDAR1拮抗劑AP-5(100 nmol/d)。復(fù)合組：制備CCI動物模型后，頸后皮下注射：17β-雌二醇(2 μL/d )+ AP-5 (100 nmoL/d)。所有大鼠均于手術(shù)14 d后，再次異氟烷深麻醉后處死，取左側(cè)L4～6脊髓背根神經(jīng)節(jié)，采用免疫組織化學(xué)法和 Western blot 法測定脊髓背根神經(jīng)節(jié)NMDARl蛋白的表達(dá)。

1.2.2檢測指標(biāo)及方法

1.2.2.1機械刺激縮足反射閾值測定 于術(shù)前1 d(T0)、術(shù)后1 d(T1)、3 d(T2)、7 d(T3)、14 d(T4)，測定大鼠機械刺激縮足反射閾值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)，測試前將大鼠置于底為5 mm×5 mm的金屬絲網(wǎng)眼墊的獨立分隔的透明有機玻璃箱內(nèi)，環(huán)境適應(yīng)30 min，以減少正式測試時由于對陌生環(huán)境的應(yīng)激而干擾實驗結(jié)果。然后按照質(zhì)量遞增的順序(1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0 g)依次施加von Frey纖維絲(stoeling公司，意大利) ，垂直刺激大鼠左后肢足底中部，為了防止測試對實驗動物造成實質(zhì)性的損傷，實驗設(shè)定的最大刺激強度為15 g，以纖毛稍稍彎曲作為完全受力的標(biāo)準(zhǔn)。PWMT閾值為使大鼠出現(xiàn)抬足或添足時，施加von Frey纖維絲最小克數(shù)的值，每次刺激持續(xù)5 s，間隔30 s以上，連續(xù)5次。取中間3個數(shù)值求平均值。所有測試都在8：00-10：00。

1.2.2.2熱刺激縮足反射潛伏期測定 于T0、T1、T2、T3、T4時點，測定大鼠熱刺激縮足反射潛伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL),使用PL-200熱刺痛儀(成都泰盟科技有限公司)，測定大鼠左后肢足底中部皮膚對熱刺激的反應(yīng)，PWTL閾值為從照射到以出現(xiàn)抬足、躲避或舔足動作的縮足反應(yīng)的時間。間隔5 min，連續(xù)測定5次，取中間3個數(shù)值求平均值，為了防止測試對實驗動物造成實質(zhì)性的損傷，單次照射不超過20 s。

1.2.2.3免疫組織化學(xué)法測定脊髓背根神經(jīng)節(jié)NMDARl T4時點測定痛閾后，每組隨機取5只大鼠，異氟烷深麻醉后，仰臥固定，快速開胸，暴露心臟，經(jīng)左心室插管至升主動脈，剪開右心耳，進(jìn)行心臟灌注。先以4 ℃無菌生理鹽水快速灌注，至流出的液體變清亮，再用4%多聚甲醛先快后慢灌流固定約30 min。大鼠取俯臥位，清除左后肢毛發(fā)，在股骨中心處解剖鈍性分離肌腱，找到坐骨神經(jīng)，沿坐骨神經(jīng)上行找到與之相連的L4～6脊神經(jīng)節(jié)，分離并取出，置于10%的中性甲醛固定48 h，石蠟包埋，4 mm連續(xù)切片。按照SP二步法免疫組織化學(xué)試劑盒說明書(中杉金橋,北京)進(jìn)行染色，每只大鼠做5張切片。主要過程包括：(1)3%的H2O2，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；(2)用枸櫞酸在高溫和高壓下對樣品進(jìn)行8 min的抗原修復(fù)，然后冷卻至室溫；(3)在室溫下，用1×磷酸鹽緩沖液沖洗3次(5分/次)；(4)NMDAR1一抗(1∶800，兔抗，ab59302，Abcam公司，英國)50 μL滴于玻片上，4 ℃冰箱孵育12 h；(5)每張切片在室溫(20～25 ℃)加50 μL加入二抗即用型免疫組織化學(xué)MaxVisionTM試劑盒(1∶200,山羊抗兔，KIT-5005，邁新生物技術(shù)，福州)；(6)DAB顯色，蘇木精復(fù)染，二甲苯透明，中性樹脂封片。大鼠L4～6脊髓背根神經(jīng)節(jié)陽性細(xì)胞，多為圓形或橢圓形的神經(jīng)元，定位于細(xì)胞質(zhì)，胞質(zhì)呈棕黃色，呈強陽性表達(dá)。測量NMDARl免疫反應(yīng)的平均吸光度(A)值，用采用MoticMed 6.0數(shù)碼彩色醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(北京麥克奧迪公司)進(jìn)行NMDARl平均光密度測定。

1.2.2.4Western blot法測定脊髓背根神經(jīng)節(jié)NMDARl 將每組剩余的5只大鼠，異氟烷深麻醉后斷頭，立即取L4～6脊神經(jīng)節(jié)，在冰浴下將上述組織勻漿，抽提總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣本40 μg與等體積的上樣緩沖液混合，煮沸8 min，迅速冷卻，8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后，轉(zhuǎn)至0.25 μm PVDF膜,5%脫脂奶粉(1 g脫脂奶粉,20 mL 1×TBST,0.5 mL吐溫20)室溫封閉1 h，加入NMDARl一抗(1∶200，兔抗，ab59302，Abcam公司，英國)和內(nèi)參β-actin(1∶1 000，小鼠抗，中杉金橋，中國)，4 ℃孵育12 h，1×TBST清洗5 min×6次，加二抗(1∶4 000，山羊抗兔，Santa Cruz公司，美國)，室溫(25 ℃)條件下孵育2 h，ECL超敏發(fā)光試劑盒(Thermo公司,34094,中國)顯色,用ImagePro4.0軟件(Bid-Rad公司,美國)對蛋白條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1一般結(jié)果 5組大鼠均無傷口感染，自由覓食。假手術(shù)組活動如常。CCI、雌二醇組、拮抗劑組、復(fù)合組，術(shù)后出現(xiàn)手術(shù)側(cè)足趾并攏，偶有外翻，患肢行走可呈現(xiàn)跛行；站立時可見后足懸空，不敢著地，以健側(cè)肢體持重，有舔足等保護(hù)動作，均無自噬現(xiàn)象，表明建模成功。

2.2PWMT和PWTL測定結(jié)果 與假手術(shù)組比較，術(shù)后所有時點，CCI組和雌二醇組大鼠PWMT降低，PWTL縮短(P<0.05)。與CCI組比較，雌二醇組大鼠術(shù)后所有時點，均表現(xiàn)出PWMT降低，PWTL縮短(P<0.05)，見表1、2。

表1 各組大鼠不同時間段PWMT比較

a：P<0.05,與假手術(shù)組同時點比較；b：P<0.05,與CCI組同時點比較

表2 各組大鼠不同時間段PWTL比較

a：P<0.05,與假手術(shù)組同時點比較；b：P<0.05,與CCI組同時點比較

A:假手術(shù)組；B：CCI組；C：雌二醇組；D：拮抗劑組；E：復(fù)合組

圖1各組免疫組織化學(xué)檢測的結(jié)果(×200)

2.3免疫組織化學(xué)結(jié)果 大鼠L4～6脊髓背根神經(jīng)節(jié)陽性細(xì)胞，多為圓形或橢圓形的神經(jīng)元，定位于細(xì)胞質(zhì)，胞質(zhì)呈棕黃色，呈強陽性表達(dá)，見圖1。假手術(shù)組、CCI組、雌二醇組、拮抗劑組、復(fù)合組A值分別為0.42±0.05、0.71±0.06、0.93±0.11、0.67±0.07、0.73±0.06。與假手術(shù)組比較，其余各組A顯著升高(P<0.05)；與CCI組比較，雌二醇組A顯著升高(P<0.05)。

2.4Western blot結(jié)果 與假手術(shù)組比較，其余各組的NMDARl表達(dá)增高(P<0.05)；與CCI組比較，雌二醇組的NMDARl表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見圖2。

a：P<0.05,與假手術(shù)組同時點比較；b：P<0.05,與CCI組同時點比較

圖2各組Western blot檢測的結(jié)果

3 討 論

國內(nèi)外不同領(lǐng)域的研究者均都圍繞神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生，激發(fā)及傳導(dǎo)的機制，解剖學(xué)和組織形態(tài)學(xué)變化，分子生物學(xué)及電生理學(xué)等試圖對攻克神經(jīng)病理性痛進(jìn)行了研究，但迄今為止對神經(jīng)病理性痛機制的認(rèn)識仍十分局限,效果都不甚滿意[6]。神經(jīng)損傷致痛模型可分為：坐骨神經(jīng)慢性縮窄性損傷模型、脊神經(jīng)結(jié)扎模型、背神經(jīng)節(jié)慢性壓迫模型等[7]。以上模型各有優(yōu)勢，本研究采用CCI模型，因為與其他模型相比，其損傷程度可控性強，疼痛變化穩(wěn)定，重復(fù)操作效果基本一致[8]，本研究的大鼠在造模后，除假手術(shù)組外，其余各組的疼痛感在術(shù)后第1天即可出現(xiàn)并持久至術(shù)后第7天達(dá)到峰值，在術(shù)后各時點PWMT明顯降低，PWTL顯著縮短，證明建模成功，大鼠行為學(xué)結(jié)果顯示,在術(shù)后各時點雌二醇組與CCI組比較，大鼠的PWMT降低更明顯，PWTL時間更短，提示，雌激素可能在慢性神經(jīng)病理性疼痛狀況下，提高了機體對傷害性機械刺激和熱刺激的敏感性，降低動物熱痛閾，使機體對機械刺激和熱刺激耐受能力下降，提示雌激素可能在病理狀況下，在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮了作用，參與了疼痛的傳遞，并從行為學(xué)方面驗證了雌激素可能增加了CCI模型大鼠患肢的敏感性。提示雌激素水平較高的大鼠對疼痛的反應(yīng)更敏感,其機制可能是，雌激素在病理狀況下，在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮了作用，參與了疼痛的傳遞，并從行為學(xué)方面驗證了雌激素增加了CCI模型大鼠患肢的敏感性。本研究所測大鼠的痛域為機械痛域和熱痛域，它們是大鼠痛域的兩種表現(xiàn)形式，有研究顯示機械痛閾的改變反應(yīng)的是有髓神經(jīng)介導(dǎo)的痛覺信號的變化，而熱痛閾的改變反應(yīng)的是無髓C纖維介導(dǎo)的痛覺信號的變化。因此雌激素組大鼠可能是由于雌激素放大了有髓神經(jīng)和無髓C纖維介導(dǎo)的痛覺信號，而降低了大鼠的痛域，使痛覺敏化并產(chǎn)生痛覺超敏的結(jié)果。

N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)是存在于神經(jīng)系統(tǒng)的正常興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸受體，參與疼痛的生成、傳播和維護(hù)過程。NMDA受體活性調(diào)節(jié)的失衡與神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制密切相關(guān)。不同神經(jīng)系統(tǒng)疾病狀態(tài)下，NMDA受體的表達(dá)變化也不同[9]。以往對NMDA受體蛋白與神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系的研究多集中在腦和脊髓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而本文取材L4～6脊神經(jīng)節(jié)，脊神經(jīng)內(nèi)含假單極神經(jīng)元，為疼痛感覺傳入神經(jīng)的第一級神經(jīng)元[10]，本實驗結(jié)果也顯示，經(jīng)坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎過的大鼠術(shù)側(cè)的背根神經(jīng)節(jié)L4～6NMDAR1的平均光密度值升高，表達(dá)增強，提示NMDAR1的上調(diào)可能是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展的一種重要參與途徑，結(jié)果同時顯示經(jīng)過17β-雌二醇干預(yù)后，雌二醇組大鼠術(shù)側(cè)的背根神經(jīng)節(jié)L4-6NMDAR1的平均光密度值升高更明顯，表達(dá)量與CCI組差異顯著，這與行為學(xué)結(jié)果相一致，提示雌激素參與并增加了大鼠神經(jīng)病理性疼痛的敏感性。

本研究結(jié)果也顯示雌激素大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)原上NMDAR1受體1顯著增加，大鼠疼痛超敏，其原因可能是雌激素受體和NMDA受體在背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)原上都有分布，位置重疊，在背根神經(jīng)節(jié)上共表達(dá)，雌激素對NMDA受體產(chǎn)生了有直接作用，通過上調(diào)NMDA受體的表達(dá)增加功能和通道開放來增強背根神經(jīng)節(jié)傷害性刺激的傳遞。大量的實驗證據(jù)表明，人和動物對病理性神經(jīng)痛均存在性別差異，對雌激素與NMDA受體關(guān)系的研究，也主要針對可調(diào)節(jié)腦內(nèi)幾個區(qū)域和脊髓神經(jīng)元的NMDA受體活性[11]。表明雌激素通過調(diào)節(jié)谷氨酸受體的表達(dá)或翻譯后修飾[12]，改變腦內(nèi)谷氨酸受體傳遞[13]，雌激素增加了NMDA受體介導(dǎo)的下丘腦神經(jīng)元興奮，本研究通過Western blot及免疫組織化學(xué)法檢測神經(jīng)損傷后脊髓背根神經(jīng)節(jié)上NMDAR受體亞基表達(dá)情況，得出了一致的結(jié)果，而運用NMDAR特異性拮抗劑AP-5可以使NMDA受體表達(dá)水平下降[14]，從而使大鼠的疼痛閾值顯著提高[15]，由此可見，NMDA受體的NMDA1調(diào)節(jié)亞基在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。

綜上，本研究認(rèn)為雌激素在慢性神經(jīng)病理性疼痛狀況下，可以提高機體對機械刺激和熱刺激的敏感性，其機制可能是增加了NMDAR1的表達(dá)，對防治病理性神經(jīng)痛提供了新的思路。

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