Map3k1基因下調(diào)對(duì)B6小鼠眼瞼角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和遷移能力的影響*

景 瑾，劉莉莉，尤 杰，夏婷婷，張 進(jìn)，劉 春，朱順星△

(1.南通大學(xué)杏林學(xué)院，江蘇南通 226001；2.南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，江蘇南通 226001)

研究表明眼瞼發(fā)育異常主要是由于眼瞼角質(zhì)形成細(xì)胞遷移受阻所致[1]。大量資料顯示，Map3k1基因在小鼠眼瞼形態(tài)建成過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。Map3k1是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的重要成員，其表達(dá)的蛋白細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(MEKK1)具有廣泛的生物學(xué)功能。MEKK1蛋白是MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的結(jié)點(diǎn)，可以調(diào)節(jié)JNK[2]、ERK1/2[3]、P38[4]、IKK-NFκB[5]等信號(hào)通路，這些信號(hào)通路參與調(diào)控相關(guān)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等[2-5]，對(duì)細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)起著至關(guān)重要的作用。本研究擬采用RNA干擾技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)Map3k1的特異性沉默，來(lái)檢測(cè)其對(duì)B6小鼠眼瞼角質(zhì)形成細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 B6(C57BL/6，B6)小鼠購(gòu)自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)在清潔級(jí)屏障動(dòng)物房?jī)?nèi)， 室內(nèi)溫度為(23±2)℃， 濕度控制為(55±5)%，自由采食和飲水，室內(nèi)照明采用12 h∶12 h 明暗交替，定期更換籠具、墊料。

1.1.2主要儀器及試劑 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司(美國(guó))；倒置相差顯微鏡購(gòu)自Leica公司(德國(guó))；抗菌藥物、大豆胰蛋白酶抑制劑購(gòu)自Amresco公司(美國(guó))；角質(zhì)形成細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(DK-SFM)、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)購(gòu)自Gibco公司(美國(guó))；中性蛋白酶Ⅱ購(gòu)自Roche公司(瑞士)；24孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自Corning公司(美國(guó))；質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司(美國(guó))；Mouse monoclonal to MEKK1購(gòu)自Abcam公司(英國(guó))；Anti-Mouse IgG、HRP-linked Antibody購(gòu)自Cell Signaling公司(美國(guó))。

1.2方法

1.2.1B6小鼠眼瞼角質(zhì)形成細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng) 取1 d B6小鼠，超凈臺(tái)中取眼瞼，在75%乙醇中清洗，然后在0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中清洗；將眼瞼放入添加有中性蛋白酶Ⅱ(3 mg/mL)和抗菌藥物的DK-SFM 培養(yǎng)液中，4 ℃消化18 h；加入等體積的PBS，分離真皮和表皮，將表皮充分剪碎，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA，37 ℃消化約10 min；再加入大豆胰蛋白酶抑制劑終止消化，1 200 r/min 室溫離心5 min，棄上清液，PBS清洗一遍，加入含有10 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的DK-SFM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL；將細(xì)胞接種于12孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后更換培養(yǎng)液，每隔1 d換液1次。

1.2.2靶向沉默Map3k1基因的amiRNA表達(dá)載體 本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中已成功構(gòu)建靶向沉默Map3k1基因的amiRNA表達(dá)載體，并篩選出干擾效率最高的質(zhì)粒[6]。Map3k1基因序列的miRNA靶向序列如下，miRNA3-F:5′-TGC TGA TCC ATC TCC TTT AAT AGG GAG TTT TGG CCA CTG ACT GAC TCC CTA TTA GGA GAT GGA T-3′;miRNA3-R:5′-CCT GAT CCA TCT CCT AAT AGG GAG TCA GTC AGT GGC CAA AAC TCC CTA TTA AAG GAG ATG GAT C-3。

1.2.3菌種復(fù)性與質(zhì)粒抽提 -80 ℃冰箱中取出之前所保存的菌種，冰上溶解；吸取50 μL于1 mL LB液體培養(yǎng)基(含Amp+)中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)1 h；菌種狀態(tài)良好時(shí)，直接以劃線法涂LB平板[含氨芐青霉素(Amp+)]，倒扣平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；用10 μL槍頭挑取平板上單克隆菌落至5 mL LB液體培養(yǎng)基(含Amp+)中，37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜，1 mL保種，1 mL送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序；測(cè)序正確的再次搖菌，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，獲得的質(zhì)粒，核酸蛋白定量?jī)x測(cè)濃度，-20 ℃存儲(chǔ)備用；分裝部分抽提的質(zhì)粒DNA，送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.4Map3k1 amiRNA-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B6小鼠眼瞼角質(zhì)形成細(xì)胞 取2 μL Map3k1 amiRNA-3質(zhì)粒(568 ng/μL)溶于100 μL Opti-MEM基培中，取2 μL Lipofectamin 2000溶于100 μL Opti-MEM基培中，分別輕輕混勻，室溫各孵育5 min；將兩個(gè)混合液輕輕混勻，室溫孵育20 min；角質(zhì)形成細(xì)胞換液，更換DK-SFM 培養(yǎng)液800 μL；混合液加入12孔板中，輕輕混勻，細(xì)胞于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后更換DK-SFM 培養(yǎng)液。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24、48、72 h分別提取總RNA和總蛋白。

1.2.5Real-Time PCR檢測(cè)Map3k1 mRNA相對(duì)表達(dá)量 根據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)要求提取細(xì)胞總RNA，采用TRIzol法提取。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Roche公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。根據(jù)Map3k1基因mRNA設(shè)計(jì)RT-PCR反應(yīng)引物如下，GAPDH-F:5′-GGA GCG AGA CCC CAC TAA C-3′,GAPDH-R:5′-GGC GGA GAT GAT GAC CCT-3′;Map3k1-F:5′-GGT CCT AAG AGG TCA GCA GTA TG-3′,Map3k1-R:5′- GGA CAG GTG TGA CGG GAT G-3′。RT-PCR反應(yīng)采用SYBR Green MiX試劑，反應(yīng)體系如下：SYBR Green mix 10 μL、 Primer-F(10 pmol)0.5 μL 、Primer-R(10 pmol)0.5 μL 、cDNA 1 μL、ddH2O 8 μL。RT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃，5 min；45個(gè)循環(huán)(95 ℃，15 s；60 ℃，20 s；72 ℃，30 s)，每個(gè)循環(huán)在延伸階段收集熒光；產(chǎn)物熔解曲線分析：95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。各組細(xì)胞目的基因均以內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行校正，為了減少誤差，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3批樣本，每個(gè)樣本均重復(fù)3次，使用2-ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.6Western blot檢測(cè)Map3k1蛋白相對(duì)表達(dá)量 根據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)要求提取各組細(xì)胞總蛋白；并取適量以BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度；按說(shuō)明書(shū)配制分離膠及濃縮膠：Gapdh配制12%的分離膠，Map3k1配制6%的分離膠；常規(guī)程序電泳，直至目的蛋白充分跑開(kāi)；電泳結(jié)束后，Gapdh以300 mA，60 min的條件轉(zhuǎn)膜，Map3k1以110 V，120 min的條件轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜取出，置于封閉液中室溫封閉2 h；在膜上滴加適量1∶1 000稀釋的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；用TBST洗滌1次，TBS洗滌2次；加二抗室溫孵育2 h；再用TBST洗滌1次，TBS洗滌2次，取1 mL ECL顯色液顯色1 min。

1.2.7四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)B6小鼠眼瞼角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化后離心收集，加入DK-SFM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整為 2×104/mL。將制備好的細(xì)胞懸液邊輕輕混勻邊加入96 孔板，每孔加入 100 μL；將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，第2天做轉(zhuǎn)染，分為Ctrl Map3k1組與Map3k1 amiRNA-3組，Ctrl Map3k1組只加入培養(yǎng)基不加細(xì)胞，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔取均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。在轉(zhuǎn)染24、48、72 h后MTT法測(cè)細(xì)胞活力；不同時(shí)間Map3k1 amiRNA-3組及Ctrl Map3k1組每孔加入10 μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h；再加入 100 μL Formanzan溶解液，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育約4 h，顯微鏡下觀察待結(jié)晶物充分溶解后，在酶標(biāo)儀吸光度(A)570 nm處測(cè)量各孔的A值。

1.2.8劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)B6小鼠眼瞼角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種到24孔板，每孔接種1×106個(gè)細(xì)胞，并設(shè)3個(gè)重復(fù)；Map3k1 amiRNA-3組與Ctrl Map3k1組于轉(zhuǎn)染36 h后，棄原培養(yǎng)液，加入含有10 μg/mL 絲裂霉素C的DK-SFM培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h；然后用100 μL的槍頭在每個(gè)孔的中央進(jìn)行十字劃痕；吸去培養(yǎng)液，0.01 mol/L PBS 輕洗；加入含有10 ng/mL EGF的DK-SFM 培養(yǎng)液，于十字劃痕處顯微鏡觀察拍照，記為0 h，每孔照數(shù)個(gè)不同的位置；培養(yǎng)24 h 后，依據(jù)記錄的大致位置再次拍照。

2 結(jié) 果

2.1Map3k1 amiRNA-3干擾質(zhì)粒 測(cè)序結(jié)果與預(yù)期完全吻合(圖1)，miRNA序列正確插入pcDNA-miRNA載體中。

2.2Map3k1 amiRNA-3質(zhì)粒對(duì)Map3k1基因的干擾效率 Real-time PCR結(jié)果(圖2A)表明在轉(zhuǎn)染Map3k1 amiR-3質(zhì)粒后48 h，B6小鼠眼瞼角質(zhì)形成細(xì)胞Map3k1基因mRNA的表達(dá)量下降最為顯著，干擾效率高達(dá)70%(P<0.01)；Western blot結(jié)果(圖2B、C)表明在轉(zhuǎn)染Map3k1 amiR-3質(zhì)粒后72 h，B6小鼠眼瞼角質(zhì)形成細(xì)胞Map3k1基因蛋白的表達(dá)量下降最為顯著，干擾效率高達(dá)70%(P<0.05)。

A:Real-Time PCR檢測(cè)Map3k1 mRNA相對(duì)表達(dá)量；B：Western blot檢測(cè)Map3k1 amiRNA-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量；C：Map3k1 amiRNA-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量；a：P<0.05，b：P<0.01

圖2 Real-Time PCR、Western blot檢測(cè)Map3k1 amiRNA-3的干擾效率

2.3MTT法檢測(cè)B6小鼠眼瞼角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖水平 細(xì)胞增殖水平檢測(cè)結(jié)果顯示：Map3k1 amiRNA-3組在轉(zhuǎn)染24、48、72 h細(xì)胞增殖水平顯著低于Ctrl amiRNA組(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖3。

表1 MTT法不同時(shí)間細(xì)胞增殖水平檢測(cè)

a：P<0.05，b：P<0.01，與Ctrl amiRNA組比較

2.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)B6小鼠眼瞼角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移能力 Map3k1 amiRNA-3組角質(zhì)形成細(xì)胞，在劃痕后24 h，其穿過(guò)劃痕區(qū)的細(xì)胞數(shù)量與相對(duì)距離均明顯低于轉(zhuǎn)染空載體的Ctrl amiRNA組(圖4)，定量分析發(fā)現(xiàn)Ctrl amiRNA組遷移的細(xì)胞數(shù)為(615±39)個(gè)，Map3k1 amiRNA-3組僅有(325±34)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；細(xì)胞遷移劃痕區(qū)的相對(duì)距離，Ctrl amiRNA組為(0.339±0.015)，MAp3k1 amiRNA-3組為(0.181±0.027)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)B6小鼠眼瞼角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移能力

3 討 論

眼瞼是眼球前的軟組織，當(dāng)眼受到外界各種刺激時(shí)，可通過(guò)中樞神經(jīng)的指揮及時(shí)將其關(guān)閉，從而阻擋外來(lái)異物或強(qiáng)光對(duì)眼睛造成傷害，對(duì)眼的發(fā)育和保護(hù)具有重要作用。若眼瞼發(fā)育異常便會(huì)受到各種眼部疾病的困擾，如角膜病、白內(nèi)障、視力減退等。研究表明眼瞼發(fā)育異常主要是由于眼瞼角質(zhì)形成細(xì)胞遷移受阻所致[1]。有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)MEKK1的轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以引發(fā)角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移，MEKK1對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)有著至關(guān)重要的作用[7]。

RNA干擾是由雙鏈RNA(dsRNA)誘發(fā)同源mRNA高效且特異性降解的現(xiàn)象，可以特異性剔除或關(guān)閉目的基因的表達(dá)，該技術(shù)具有成本低廉、高效率、高特異性、操作方便等優(yōu)勢(shì)[8-10]，已成為各大實(shí)驗(yàn)室探索基因功能的常用技術(shù)。

Map3k1基因位于5q11.2，其編碼的蛋白稱為MEKK1，全長(zhǎng)196×103。MEKK1是MAPK家族中的重要成員，具有Ser/Thr激酶活性，其C-端為催化結(jié)構(gòu)域，N-端為調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，可以磷酸化與其結(jié)合的下游靶蛋白，從而介導(dǎo)蛋白間的相互作用并影響其行為和生物學(xué)功能。MEKK1蛋白是MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的結(jié)點(diǎn)，可以調(diào)節(jié)JNK[2]、ERK1/2[3]、P38[4]、IKK-NFκB[5]等信號(hào)通路，這些信號(hào)通路參與調(diào)控相關(guān)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等[2-5]。Map3k1對(duì)細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展起著至關(guān)重要的作用，有研究表明Map3k1具有可決定細(xì)胞命運(yùn)的開(kāi)關(guān)樣功能，即促進(jìn)和抑制細(xì)胞凋亡的雙重作用[11]。而MEKK1 作為幾個(gè) MAPK 通路的上游調(diào)節(jié)因子，亦涉及不同種類和細(xì)胞類型的生物學(xué)反應(yīng)，包括角質(zhì)形成細(xì)胞的分化、T細(xì)胞活化和壓力刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等。因而，本研究擬采用RNA干擾技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)Map3k1的特異性沉默，來(lái)檢測(cè)其對(duì)B6小鼠眼瞼角質(zhì)形成細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。期許為更好的理解、掌握Map3k1在B6小鼠眼瞼角質(zhì)形成細(xì)胞中的作用，及其在眼瞼發(fā)育過(guò)程中的作用提供理論依據(jù)。

首先通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)中已成功構(gòu)建靶向沉默Map3k1基因的amiRNA表達(dá)載體[6]，實(shí)現(xiàn)對(duì)Map3k1的特異性沉默，干擾效率高達(dá)70%，為研究B6小鼠眼瞼角質(zhì)形成細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)在干擾Map3k1前后的變化奠定了基礎(chǔ)。

Map3k1基因參與調(diào)節(jié)各種類型的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移，研究發(fā)現(xiàn)Map3k1基因敲除的新生鼠由于上皮細(xì)胞遷移缺陷，導(dǎo)致出生時(shí)眼瞼不能閉合[12]，說(shuō)明Map3k1基因在小鼠眼瞼形態(tài)建成過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。Map3k1表達(dá)的缺乏可減少細(xì)胞的遷移和侵襲能力[13]。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)靶向抑制Map3k1的表達(dá)后，B6小鼠眼瞼角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移能力被顯著抑制，無(wú)論是遷移的距離還是遷移的細(xì)胞數(shù)量都顯著下調(diào)(P<0.05)。此外，還發(fā)現(xiàn)Map3k1的表達(dá)被抑制后，會(huì)影響B(tài)6小鼠眼瞼角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力(P<0.05)。這些結(jié)果表明靶向抑制Map3k1的表達(dá)能夠廣泛的影響B(tài)6小鼠眼瞼角質(zhì)形成細(xì)胞的生物學(xué)行為，從而影響眼瞼的發(fā)育。

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