IgE高親和力受體蛋白的制備及其生物功能的鑒定

徐 婷，張 強(qiáng)，喻荷蓮，王世春，徐小敏，易中梅，蔣天倫

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院輸血科，重慶 400038)

過敏性疾病常表現(xiàn)為支氣管哮喘、過敏性鼻炎和過敏性皮膚病等，對(duì)患者的日常生活質(zhì)量有極大影響，嚴(yán)重時(shí)可危及生命，且這類疾病多由特異性IgE抗體介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)所引起[1-3]。當(dāng)Ⅰ型超敏反應(yīng)啟動(dòng)時(shí)，IgE抗體結(jié)合于其高親和力受體α段(alpha segment of high affinity IgE receptor,FcεRIα)上，IgE- FcεRIα的交聯(lián)分子可促使肥大細(xì)胞脫顆粒并釋放血管活性物質(zhì)，從而引起過敏反應(yīng)[4-5]。研究表明，F(xiàn)cεRIα 蛋白在IgE介導(dǎo)的過敏性疾病的發(fā)生中占有重要地位[6-8]。因此，本研究通過基因工程技術(shù)制備FcεRIα 蛋白并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行鑒定，為后續(xù)進(jìn)一步探討FcεRIα在過敏性疾病中的作用奠定研究基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意，從本院收集健康人和慢性蕁麻疹(chronic urticaria,CU)患者標(biāo)本各30例，健康人為對(duì)照組，CU患者為觀察組。原核載體pET-28a(+)、TOP10菌株、Arcticexpress 表達(dá)菌株均購(gòu)自南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司；DNA純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶均購(gòu)自日本Takara公司；Ni2+IDA親和層析膠購(gòu)自美國(guó)Novagen公司；小鼠抗人IgE單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 單克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Sorval公司；Biologic LP層析系統(tǒng)、Mini Protean Ⅱ垂直平板電泳系統(tǒng)、Gel Doc2000成像系統(tǒng)、水平電泳系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；PTC-200基因擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)MJ Research公司；Hofer ΜV-25紫外透射儀購(gòu)自美國(guó)Amersham Pharmacia公司；JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購(gòu)自中國(guó)新芝科技研究所；Multiskan MK3酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2方法

1.2.1人FcεRIα基因的擴(kuò)增 根據(jù)Gene Bank中人的FcεRIα mRNA序列(NM_002001.2)，采用基于PCR的精確合成法(PCR-based accurate synthesis，PAS)的方法設(shè)計(jì)全長(zhǎng)拼接引物合成基因FcεRIα，并在引物的上下游分別引入Nco Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位點(diǎn)。引物序列如下：P1 上游引物為5′-TGT TTA ACT TTA AGA AGG AGA TAT ACC ATG GGC ATG GTC CCT CAG AAA CCT AAG G-3′;P2 下游引物為5′-AGC CGG ATC TCA GTG GTG GTG GTG GTT GCT CGA GTT GTA GCC AGT ACT TCT CA-3′。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.2人FcεRIα重組表達(dá)質(zhì)粒pET-FcεRIα的構(gòu)建和鑒定 將人FcεRIα基因經(jīng)Nco Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切處理后連接至原核載體pET-28a(+)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入TOP10克隆菌株，挑取陽性克隆子經(jīng)Xba Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切鑒定正確后，送往上海生工公司測(cè)序。

1.2.3人FcεRIα的誘導(dǎo)表達(dá) 將質(zhì)粒pET-28a(+)、pET-FcεRIα均轉(zhuǎn)化至Arctic Express感受態(tài)細(xì)胞中。吸取1 mL菌液為誘導(dǎo)前對(duì)照，在剩余菌液中加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，使其終濃度為0.5 mmol/L，11 ℃ 220 r/min振搖過夜，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)后的菌液離心10 min，棄上清液，用PBS重懸菌體沉淀，后用超聲波破碎細(xì)菌，分別收集上清液與沉淀液中的蛋白樣品于12% SDS-PAGE檢測(cè)分析。

1.2.4人FcεRIα包涵體蛋白的復(fù)性及純化 收集菌體超聲破碎后的沉淀，用包涵體洗滌液(20 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，2 mol/L 尿素，1 mol/L NaCl，1% Triton X-100，pH 8.0)洗滌包涵體3次；用溶解緩沖液(20 mmol/L Tris，5 mmol/L DTT，8 mmol/L 尿素， pH 8.0)溶解包涵體，4 ℃放置過夜，于15 000 r/min 室溫離心15 min；將上述溶液滴加至透析緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，pH 8.0)中，逐步成倍梯度稀釋緩慢攪拌，將蛋白溶液裝入透析袋于透析溶液中透析過夜。將包涵體溶液以0.5 mL/min流速上樣至Ni-IDA-Sepharose CL-6B親和層析柱中，利用低壓層析系統(tǒng)對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，并采用12% SDS-PAGE檢測(cè)分析。

1.2.5ELISA檢測(cè)人血清中抗FcεRIα自身抗體的水平 將重組FcεRIα 40 ng/mL 100 μL包被于ELISA 板上，4 ℃過夜并封閉，于板孔中加入1∶100 稀釋的對(duì)照組和觀察組血清標(biāo)本，37 ℃孵育30 min；加入HRP 標(biāo)記的山羊抗人IgG(1∶5 000) ，37 ℃ 孵育30 min；洗板后，每孔加入TMB 顯色液100 μL，于37 ℃避光顯色20 min，加入50 μL H2SO4(2 mol/L) ，于20 min內(nèi)測(cè)定吸光度(A)值。

1.2.6ELISA檢測(cè)鑒定人FcεRIα重組蛋白與人血清中IgE的結(jié)合力 將重組FcεRIα 100 μL 包被于ELISA 板上，包被濃度分別設(shè)置為0、10、20、30、40、50、60 ng/mL，4 ℃過夜并封閉，于板孔中分別加入PBS(PBS組)、1∶100 稀釋的對(duì)照組和觀察組血清標(biāo)本，37 ℃孵育30 min；加入100 μL 小鼠抗人IgE(1∶1 000) ，具體操作步驟同上。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異采用單因素方差分析的SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1人 FcεRIα 基因的擴(kuò)增

2.1.1人FcεRIα基因的PCR擴(kuò)增 設(shè)計(jì)全長(zhǎng)拼接引物，通過基于PAS的方法獲得FcεRIα 胞外區(qū)段基因，經(jīng)核酸電泳顯示目的基因大小約為560 bp，見圖1。

M:DNA分子量標(biāo)記物

圖1人FcεRIα基因合成產(chǎn)物電泳圖

2.1.2重組質(zhì)粒pET-FcεRIα的酶切鑒定 采用限制性內(nèi)切酶Xba Ⅰ/Xho Ⅰ對(duì)重組質(zhì)粒pET-FcεRIα進(jìn)行雙酶切，電泳條帶大小約為5 300 bp 和600 bp，見圖2。

M:DNA分子量標(biāo)記物；1：酶切前的重組質(zhì)粒；2：酶切后的重組質(zhì)粒

圖2重組質(zhì)粒pET-FcεRIα的雙酶切鑒定

2.1.3陽性克隆子的測(cè)序結(jié)果 測(cè)序結(jié)果與GenBank中FcεRIα 的序列通過BLAST 軟件進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示陽性克隆子的序列與原始序列一致。

2.2人FcεRIα 的誘導(dǎo)表達(dá)、復(fù)性及純化

2.2.1人FcεRIα的誘導(dǎo)表達(dá) SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pET-FcεRIα在原核表達(dá)宿主Arctic Express菌株中，誘導(dǎo)條件溫度為11 ℃、IPTG 濃度為0.5 mmol/L、振搖轉(zhuǎn)速為220 r/min過夜后，有相對(duì)分子質(zhì)量約22 000大小的較濃條帶出現(xiàn)，大小與預(yù)期蛋白相對(duì)分子質(zhì)量一致，而在無誘導(dǎo)條件中則無條帶出現(xiàn)。但是，從圖3中可以發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)蛋白主要集中在誘導(dǎo)表達(dá)的菌體裂解后的沉淀中。

2.2.2人FcεRIα的復(fù)性及純化 SDS-PAGE分析蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小約為22 000(圖4)，純化后的蛋白濃度明顯高于未純化前。

2.3人FcεRIα的生物功能的鑒定

2.3.1人血清中抗FcεRIα自身抗體水平的測(cè)定 對(duì)照組中抗FcεRIα自身抗體濃度為(2.19±0.48)ng/mL,觀察組中抗FcεRIα自身抗體濃度為(13.65±1.64)ng/mL,觀察組血清中的抗FcεRIα自身抗體濃度明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。

M:蛋白分子量標(biāo)記物；1：重組質(zhì)粒未誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物；2：重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)的可溶性產(chǎn)物；3：誘導(dǎo)表達(dá)的菌體裂解后上清液；4：誘導(dǎo)表達(dá)的菌體裂解后沉淀液

圖3人FcεRIα誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析

2.3.2人FcεRIα重組蛋白與人血清中IgE的結(jié)合力測(cè)定 將不同濃度的重組人FcεRIα分別包被于ELISA板，隨包被蛋白量的增加，A值逐漸增大。當(dāng)包被量繼續(xù)增加時(shí)，A值不再繼續(xù)增大。在包被蛋白量相同的條件下，觀察組血清的A值均大于對(duì)照組(P<0.05，表1)。PBS組A值小于0.1，由此能判斷重組的人FcεRIα可與人血清中的IgE 結(jié)合，見表1。

M:蛋白分子量標(biāo)記物；1：未純化的表達(dá)產(chǎn)物；2：穿透液；3：洗脫液

圖4 人FcεRIα復(fù)性及純化的SDS-PAGE分析表1 各組不同濃度人FcεRIα重組蛋白與血清中IgE結(jié)合的A值比較

a：P<0.05，與對(duì)照組比較

3 討 論

本研究利用pET原核表達(dá)系統(tǒng)在體外成功制備了人FcεRIα蛋白并對(duì)重組蛋白的生物學(xué)功能進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，通過pET-28a(+)質(zhì)?？寺”磉_(dá)出的重組人FcεRIα蛋白能夠有效地檢測(cè)慢性蕁麻疹患者血清中的抗FcεRIα抗體水平，并且能夠與人血清中的IgE結(jié)合。本研究中的原核表達(dá)系統(tǒng)采用的是T7啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可調(diào)控目的基因的高效表達(dá)，同時(shí)在目的蛋白中融合His標(biāo)簽，有便于表達(dá)后的親和純化。實(shí)驗(yàn)采用低誘導(dǎo)溫度(11 ℃)和低IPTG濃度(0.5 mmol/L)，通過減慢蛋白合成速率，從而改變多肽折疊的動(dòng)力學(xué)，進(jìn)一步增加蛋白的正確折疊，為重組蛋白的正確表達(dá)提供了更有利的條件。

FcεRI是一個(gè)異四聚體結(jié)構(gòu)，具有一條α鏈，一條β鏈，兩條γ鏈，膜外區(qū)α鏈?zhǔn)荌gE的結(jié)合部位，也是觸發(fā)過敏反應(yīng)的基本單位[9]。當(dāng)多價(jià)抗原與IgE交聯(lián)時(shí)，受體即發(fā)生微聚集而被激活，經(jīng)過蛋白激酶活化、磷脂酰肌醇水解及鈣離子流動(dòng)等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，使肥大細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞發(fā)生釋放炎性介質(zhì)、分泌細(xì)胞因子及表達(dá)黏附分子等生物學(xué)反應(yīng)，參與過敏性炎癥的形成，從而引起過敏反應(yīng)。在此過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血清中IgE水平上升時(shí)，細(xì)胞表面的FcεRI表達(dá)也出現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象[5,10]。因此，由IgE-FcεRI介導(dǎo)的肥大細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞活化被認(rèn)為是速發(fā)性過敏反應(yīng)的一個(gè)重要標(biāo)志。近年來，關(guān)于IgE在過敏反應(yīng)中的介導(dǎo)作用已逐漸清楚，越來越多的研究更多集中在FcεRIα上，尤其是在由抗FcεRIα自身抗體所引起的自身免疫性蕁麻疹等疾病的研究中[11]。

在體外實(shí)驗(yàn)中，將自身免疫性蕁麻疹患者血清與重組FcεRIα胞外區(qū)一起孵育，可抑制組胺釋放，提示抗FcεRIα自身抗體結(jié)合的表位位于FcεRI的α鏈上。這種針對(duì)FcεRIα的自身抗體作為致病因子存在于約12%～30%的慢性蕁麻疹患者血清中，并且這種自身抗體在自身免疫性慢性蕁麻疹發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[12-13]。在經(jīng)典的Ⅰ型過敏反應(yīng)中，抗原與結(jié)合于FcεRI上的IgE發(fā)生交聯(lián)，激活信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞脫顆粒而發(fā)生過敏，但在自身免疫性慢性蕁麻疹中，IgG-抗IgE自身抗體與結(jié)合在FcεRI上的IgE發(fā)生交聯(lián)，或IgG-抗FcεRIα自身抗體使相鄰FcεRI直接交聯(lián)來激活效應(yīng)細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)[14-15]。但是，目前國(guó)內(nèi)在臨床上尚未出現(xiàn)這類自身抗體的商品化診斷試劑盒，嚴(yán)重影響了抗FcεRIα自身抗體引起的此類疾病的診斷。因此，本研究通過基因工程技術(shù)制備了FcεRIα 蛋白并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行了鑒定，不僅為抗FcεRIα自身抗體的診斷研究提供了實(shí)踐基礎(chǔ)，同時(shí)為后續(xù)進(jìn)一步探討FcεRIα在IgE介導(dǎo)的過敏性疾病中的作用奠定了研究基礎(chǔ)。

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