抑制DNA-PKcs對(duì)放射治療后食管鱗癌細(xì)胞系EC109自噬蛋白表達(dá)和增殖的影響*

孫 佳，趙曉靜，袁 翎，李雨濛，李 南，張中冕，王豪勛，韓 娜，馬 軍，王 健△

(1.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科，河南鄭州 450014；2鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院，河南鄭州 450008；3鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南鄭州 450014)

我國(guó)是食管鱗癌高發(fā)區(qū)，約90%的食管癌為鱗狀細(xì)胞癌[1]，是第四大癌癥死亡原因。放療是食管癌的主要治療方法之一， DNA雙鍵斷裂(DSBs)是放療造成DNA損傷的主要類型。腫瘤細(xì)胞可通過(guò)同源重組(HR)和非同源末端連接(NHEJ)對(duì)DSBs進(jìn)行修復(fù)[2]，降低放療敏感性。真核細(xì)胞中DSBs主要由NHEJ修復(fù)，DNA-PKcs(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)是NHEJ的中心因子，因此可通過(guò)抑制DNA-PKcs增加放療敏感性。NU7441是一種新型的DNA-PKcs抑制劑，可抑制DNA-PKcs磷酸化[3]，從而抑制DSBs修復(fù)[4-5]。自噬是保守的細(xì)胞內(nèi)過(guò)程。通過(guò)雙層膜囊泡即自噬體與溶酶體融合，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的降解。自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能具有抗腫瘤和促進(jìn)腫瘤發(fā)生的雙重作用[6-7]。藥物及放射照射可造成腫瘤細(xì)胞DNA損傷，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自噬現(xiàn)象，但自噬在DNA損傷、細(xì)胞死亡和增殖中的作用存在爭(zhēng)議[8-10]。本研究用X射線照射誘導(dǎo)EC109細(xì)胞DNA斷裂，用DNA-PKcs抑制劑NU7441抑制腫瘤細(xì)胞DSBs的自我修復(fù)過(guò)程，檢測(cè)自噬蛋白表達(dá)，探討阻斷食管鱗癌細(xì)胞DNA修復(fù)對(duì)其自噬過(guò)程的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 食管鱗癌細(xì)胞系EC109為鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化疾病研究所保存；RMPI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素混合液購(gòu)于上海生工公司；磷酸化DNA-PKcs(ab18192)購(gòu)于英國(guó)Abcam；總DNA-PKcs(4602S)、Beclin-1(3495S)、LC3B(2775S)、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(7074S)購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology；凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美天旎公司(130-092-052)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和處理 EC109細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青鏈霉素)，培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱。細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，加入NU7441(8 μmol/L)并進(jìn)行X射線照射。前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相同濃度伊立替康作用下，隨著NU7441濃度逐漸增大，對(duì)細(xì)胞的抑制率也逐漸增大，呈濃度依賴性， NU7441在8 μmol/L時(shí)抑制效應(yīng)最強(qiáng)，因此本研究中選8 μmol/L進(jìn)行細(xì)胞處理。照射采用固定源皮距SSD照射，照射距離d為100 cm,照射劑量率600 MU/min,根據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[11],采用一次照射，劑量設(shè)為8 Gy(瑞典Elekta公司Synergy直線加速器)。實(shí)驗(yàn)共分為4組(對(duì)照組、NU7441組、X-Ray組、X-Ray+NU7441組)，食管鱗癌EC109細(xì)胞經(jīng)過(guò)X射線照射和(或)NU7441處理24 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行下一步檢測(cè)。

1.2.2Western blot檢驗(yàn) 冰上用蛋白裂解液處理細(xì)胞，超聲破碎，離心后取上清液，煮沸10 min后上樣。p-DNA-PKcs、t-DNA-PKcs用5%～16%梯度分離膠電泳，轉(zhuǎn)膜12 h×250 mA。Beclin-1及LC3B用14%分離膠電泳，轉(zhuǎn)膜2 h×250 mA。5% 牛血清清蛋白(BSA)室溫封閉1 h。一抗4 ℃震蕩孵育過(guò)夜(p-DNA-PKcs、t-DNA-PKcs用1∶3 000，Beclin-1及LC3B用1∶1 000，β-actin為1∶5 000)。TBST洗膜3次后二抗孵育1 h。再次TBST洗膜3次，ECL染色，用FluorChem FC3成像儀采集圖像和灰度分析，β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3凋亡檢測(cè) 用1×Binding Buffer對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗并重懸；加入Annexin V-FITC(10 μL/106細(xì)胞)，室溫避光孵育15 min；1×Binding Buffer對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗并重懸；加入碘化丙啶(PI，5 μL/106細(xì)胞)，上機(jī)檢測(cè)；記錄每組Annexin V-FITC陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖 以每孔5×103個(gè)細(xì)胞將EC109細(xì)胞接種至96孔板，過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)胞貼壁后，分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行照射和(或)NU7441處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；作用24 h后，用PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗，每孔加入200 μL培養(yǎng)液和20 μL MTT，培養(yǎng)箱中孵育4 h；孵育結(jié)束后去除MTT，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，搖床緩慢搖10 min后，在Multiskan MK3酶標(biāo)儀測(cè)定并記錄每孔波長(zhǎng)490 nm處的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率=(A490nm實(shí)驗(yàn)組-A490nm空白組)/(A490nm對(duì)照組-A490nm空白組)。

2 結(jié) 果

2.1各組p-DNA-PKcs及t-DNA-PKcs的表達(dá)比較 對(duì)磷酸化和總DNA-PKcs的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，NU7441組食管鱗癌細(xì)胞EC109中p-DNA-PKcs表達(dá)降低(P<0.01)，X-Ray組p-DNA-PKcs表達(dá)升高(P<0.01)；與對(duì)照組相比，NU7441組t-DNA-PKcs表達(dá)降低，X-Ray組t-DNA-PKcs表達(dá)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

A:Western blot蛋白條帶；B：目的蛋白與β-actin灰度值比值柱形圖;a:P<0.05，與對(duì)照組比較

圖1各組p-DNA-PKcs及t-DNA-PKcs比較

A:Western blot蛋白條帶；B：目的蛋白與β-actin灰度值比值柱形圖;a:P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與X-Ray組比較

圖2各組Beclin-1及LC3B的表達(dá)比較

A:流式散點(diǎn)圖；B:細(xì)胞凋亡率柱狀圖；a:P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與X-Ray組比較

圖3不同處理組對(duì)食管鱗癌細(xì)胞EC109的細(xì)胞凋亡影響

2.2各組自噬蛋白Beclin-1及LC3B的表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，X-Ray+NU7441組食管鱗癌細(xì)胞EC109中Beclin-1及LC3B表達(dá)升高(P<0.05)；與X-Ray組相比，X-Ray+NU7441組Beclin-1表達(dá)升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3細(xì)胞凋亡分析 與對(duì)照組相比，單獨(dú)NU7441組細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化，X-Ray組及X-Ray+NU7441組凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與單獨(dú)NU7441組和X-Ray組相比，X-Ray+NU7441組細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

2.4MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況比較 與對(duì)照組相比，單獨(dú)NU7441組細(xì)胞增殖無(wú)明顯變化，X-Ray組及X-Ray+NU7441組增殖明顯被抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與單獨(dú)X-Ray組相比，X-Ray+NU7441組細(xì)胞抑制率明顯增加(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

a:P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與X-Ray組比較

圖4不同處理組對(duì)食管鱗癌EC109細(xì)胞增殖的影響

3 討 論

電離輻射可造成腫瘤細(xì)胞DSBs，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)HR和NHEJ兩種機(jī)制進(jìn)行修復(fù)[2]，這也是腫瘤細(xì)胞放療抵抗的重要機(jī)制之一。DNA-PKcs是NHEJ的重要成分[2]，其募集與磷酸化有助于腫瘤細(xì)胞通過(guò)NHEJ進(jìn)行DNA斷裂的修復(fù)。另外在DSBs修復(fù)中DNA-PKcs也參與DSBs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[12]。通過(guò)抑制DNA-PKcs對(duì)DSBs的修復(fù)可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。NU7441可抑制DNA-PKcs，從而抑制DSBs的修復(fù)[3-5]。前期本課題組分別用0～8 Gy作用于EC109、TE7和EC9706食管癌細(xì)胞系，結(jié)果表明在8 Gy時(shí)DNA-PKcs mRNA升高最明顯，因此將照射劑量定為8 Gy[11]。本研究中 Western blot結(jié)果顯示，X-Ray照射后食管鱗癌細(xì)胞EC109中p-DNA-PKcs表達(dá)升高；NU7441處理后，p-DNA-PKcs則表達(dá)降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。證實(shí)放射照射可誘導(dǎo)p-DNA-PKcs增多，且NU7441可有效抑制p-DNA-PKcs。t-DNA-PKcs也有類似的變化趨勢(shì)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)明顯差異，可能由于DNA-PKcs的功能主要依靠其磷酸化[3]，NU7441主要通過(guò)抑制DNA-PKcs磷酸化發(fā)揮作用。

放射照射可以促進(jìn)自噬，同時(shí)也可誘導(dǎo)DSBs和繼發(fā)的修復(fù)反應(yīng)。以往研究均表明在DNA受損后，細(xì)胞自噬增多[8-9]。為進(jìn)一步明確自噬與放射照射引起的DNA損傷間的關(guān)系，本研究用DNA-PKcs抑制劑NU7441抑制放射照射后EC109細(xì)胞DSBs修復(fù)，通過(guò)檢測(cè)自噬蛋白Beclin-1及LC3B表達(dá)水平，觀察EC109細(xì)胞自噬情況。結(jié)果顯示單獨(dú)放射照射或單獨(dú)應(yīng)用NU7441 EC109細(xì)胞自噬均增多；放射照射聯(lián)合NU7441作用EC109細(xì)胞后自噬明顯增多，表明放射照射、NU7441及放射照射聯(lián)合NU7441均可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬增多。

自噬在細(xì)胞中的作用存在爭(zhēng)議，自噬既可誘導(dǎo)受損細(xì)胞死亡，也可對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用[13]。如自噬持續(xù)激活，細(xì)胞器和關(guān)鍵蛋白被耗盡，則導(dǎo)致一種特殊形式的細(xì)胞程序性死亡。但當(dāng)處于外界壓力下如營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，自噬則為促進(jìn)細(xì)胞存活的保護(hù)性機(jī)制。同樣，自噬對(duì)放射照射所引起的DNA損傷的作用亦存在爭(zhēng)議。研究表明放療過(guò)程中自噬增加或減少均可增強(qiáng)放療敏感性[13]，如放療聯(lián)合雷帕霉素、NU7441增加自噬；聯(lián)合3-methyladenine(3-MA)、baflomycin A1(Baf-A1)、Compound C減少自噬，均可增加放療敏感性促進(jìn)細(xì)胞死亡[14-18]。但放療過(guò)程中NU7441增加自噬提高放療敏感性的結(jié)果是一致的，研究表明NU7441可提高結(jié)腸癌[4],乳腺癌[5]和前列腺癌[19]的放療敏感性，這也與本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)放射照射、放射照射聯(lián)合NU7441均使細(xì)胞凋亡明顯增多；且放射照射聯(lián)合NU7441較單獨(dú)放射照射細(xì)胞凋亡增多更加明顯。MTT亦得到相似的結(jié)果。從而證實(shí)NU7441可增加EC109細(xì)胞放療敏感性，提高放療效率。

綜上所述，本研究證實(shí)NU7441可阻斷EC109細(xì)胞放射照射后DNA-PKcs修復(fù)通路，抑制DSBs的有效修復(fù)，并發(fā)現(xiàn)阻斷EC109細(xì)胞放射照射后DNA-PKcs修復(fù)通路可促進(jìn)細(xì)胞自噬并抑制細(xì)胞增殖。

[1]TORRE L A,BRAY F,SIEGEL R L,et al.Global cancer statistics,2012[J].CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.

[2]ILIAKIS G,MURMANN T,SONI A.Alternative end-joining repair pathways are the ultimate backup for abrogated classical non-homologous end-joining and homologous recombination repair:Implications for the formation of chromosome translocations[J].Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen,2015,793:166-175.

[3]YANG C,WANG Q,LIU X,et al.NU7441 enhances the radiosensitivity of liver cancer cells[J].Cell Physiol Biochem,2016,38(5):1897-1905.

[4]ZHAO Y,THOMAS H D,BATEY M A,et al.Preclinical evaluation of a potent novel DNA-dependent protein kinase inhibitor NU7441[J].Cancer Res,2006,66(10):5354-5362.

[5]CISZEWSKI W M,TAVECCHIO M,DASTYCH J,et al.DNA-PK inhibition by NU7441 sensitizes breast cancer cells to ionizing radiation and doxorubicin[J].Breast Cancer Res Treat,2014,143(1):47-55.

[6]TANG D,KANG R,LIVESEY K M,et al.Endogenous HMGB1 regulates autophagy[J].J Cell Biol,2010,190(5):881-892.

[7]VALENCIA T,KIM J Y,ABU-BAKER S,et al.Metabolic reprogramming of stromal fibroblasts through p62-mTORC1 signaling promotes inflammation and tumorigenesis[J].Cancer Cell,2014,26(1):121-135.

[8]KANZAWA T,GERMANO I M,KOMATA T,et al.Role of autophagy in temozolomide-induced cytotoxicity for malignant glioma cells[J].Cell Death Differ,2004,11(4):448-457.

[9]ZENG X,YAN T,SCHUPP J E,et al.DNA mismatch repair initiates 6-thioguanine--induced autophagy through p53 activation in human tumor cells[J].Clin Cancer Res,2007,13(4):1315-1321.

[10]BAEH,GUANJL.Suppressionof

autophagy by FIP200 deletion impairs DNA damage repair and increases cell death upon treatments with anticancer agents[J].Mol Cancer Res,2011,9(9):1232-1241.

[11]趙曉靜，馬軍，袁翎，等．食管鱗癌細(xì)胞系TE7放射照射后miRNAs及DNA修復(fù)相關(guān)因子的表達(dá)[J]．鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2017，52(3)：247-250．

[12]DERIANO L,GUIPAUD O,MERLE-B?RAL H,et al.Human chronic lymphocytic leukemia B cells can escape DNA damage-induced apoptosis through the nonhomologous end-joining DNA repair pathway[J].Blood,2005,105(12):4776-4783.

[13]XIN Y,JIANG F,YANG C,et al.Role of autophagy in regulating the radiosensitivity of tumor cells[J].J Cancer Res Clin Oncol,2017,143(11):2147-2157.

[14]PALUMBO S,PIRTOLI L,TINI P,et al.Different involvement of autophagy in human malignant glioma cell lines undergoing irradiation and temozolomide combined treatments[J].J Cell Biochem,2012,113(7):2308-2318.

[15] YU L,SHANG Z F,HSU F M,et al.NSCLC cells demonstrate differential mode of cell death in response to the combined treatment of radiation and a DNA-PKcs inhibitor[J].Oncotarget,2015,6(6):3848-3860.

[16] LIANG B,KONG D,LIU Y,et al.Autophagy inhibition plays the synergetic killing roles with radiation in the multi-drug resistant SKVCR ovarian cancer cells[J].Radiat Oncol,2012,7:213.

[17]HAN M W,LEE J C,CHOI J Y,et al.Autophagy inhibition can overcome radioresistance in breast cancer cells through suppression of TAK1 activation[J].Anticancer Res,2014,34(3):1449-1455.

[18]盧小迪，朱小東，趙偉，等．抑制磷酸腺苷激活的蛋白激酶活性增強(qiáng)人鼻咽癌細(xì)胞放射敏感性[J]．重慶醫(yī)學(xué)，2014(22)：2900-2902．

[19]SHAHEEN F S,ZNOJEK P,FISHER A,et al.Targeting the DNA double Strand break repair machinery in prostate cancer[J].PLoS One,2011,6(5):e20311.