氣相色譜法測定醫(yī)用聚乳酸薄膜中三氯甲烷殘留量

呂麗華　黃華　陸世銀　蘇志恒

近來，聚乳酸可吸收樁膜系統(tǒng)有望為乳牙殘根、殘冠修復提供新的方法。聚乳酸作為一種新型生物降解材料，其降解時間與乳牙牙根生理吸收時間較為同步且最終以ATP、H2O及CO2形式排除體外[1-3]。將聚乳酸可吸收根管樁在一定量的三氯甲烷中充分溶解并采用溶劑揮發(fā)成膜法[4]制成聚乳酸薄膜，對可吸收根管樁與根管壁間的封閉性能良好[5]，并且具有良好的生物相容性[6]。然而，三氯甲烷疑為致癌物質[7]，人用藥品注冊技術要求國際協(xié)調會(ICH)將三氯甲烷歸為第二類溶劑，溶劑殘留限量為0.006%(60 ng/mg)，我國藥典規(guī)定三氯甲烷允許殘留限量為0.006%(60 ng/mg)[8]。為保證臨床應用安全，本實驗依據(jù)參考文獻[8]中殘留溶劑測定法，對醫(yī)用聚乳酸薄膜中三氯甲烷殘留量的測定方法進行研究，旨在建立靈敏度高，精密度好，測定結果可靠的分析方法。

1　材料與方法

1.1　儀器與試藥

GC2010 Plus氣相色譜儀、 RESTEK RTX毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm， 日本島津公司)。

醫(yī)用聚乳酸可吸收根管樁(INION，芬蘭)；三氯甲烷為分析純(99.5%，廣東汕頭市西隴化工廠)，環(huán)己烷為色譜純(99.9%，天津市光復精細化工研究所)。

1.2　色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗

1.2.1色譜條件GC2010 Plus氣相色譜儀， RESTEK RTX毛細管色譜柱； 檢測器：電子捕獲檢測器(ECD), 檢測器溫度: 270 ℃；柱溫：85 ℃維持 3 min；分流進樣方式，分流比：10∶1；進樣口溫度：200 ℃；載氣：高純氮氣，流速：1.0 ml/min；進樣量：1 μl。

1.2.2系統(tǒng)適用性及專屬性試驗

1.2.2.1對照品溶液的制備對照品貯備液：精密稱取三氯甲烷20 mg，置于100 ml棕色容量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻。

對照品溶液：精密量取對照品貯備液1 ml，置于100 ml棕色容量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻，配成2 000 ng/ml作為對照品溶液。

1.2.2.2供試品溶液的制備精密稱取聚乳酸樁0.1 g，置于具塞棕色瓶中，加入三氯甲烷50 ml，密塞，靜置3 h，待聚乳酸釘完全溶解后，將0.2 ml溶解液涂布在7 mm×20 mm的醫(yī)用載玻片上制膜(0.40 mg/張)，分別在25 ℃、37 ℃、60 ℃恒溫干燥箱中處理12、 24 h。每張薄膜加入400 μl環(huán)己烷于搖床上固定轉數(shù)浸泡10 min。

1.2.2.3加標供試品溶液的制備取已知三氯甲烷含量的薄膜樣品一張，置于棕色小瓶中，加入對照品溶液400 μl，于搖床上固定轉數(shù)浸泡10 min。

1.2.2.4測定法分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、加標供試品溶液和環(huán)己烷溶劑液各1.0 μl，在上述系統(tǒng)適應性的色譜條件下，供試品中三氯甲烷色譜峰與對照品色譜峰保留時間一致，并與其他共存成分達到基線分離，陰性無干擾，理論塔板數(shù)大于5000，各項色譜峰參數(shù)合格，色譜圖見圖 1。

圖 1色譜圖

Fig 1Chromatogram

1.3　實驗方法

1.3.1精密度試驗精密量取三氯甲烷濃度為1 000 ng/ml的溶液1 μl，按前述色譜條件，連續(xù)測定6 次，計算三氯甲烷的峰面積的RSD 0.9%。 結果顯示，三氯甲烷峰面積的RSD(%)值小于2.0%，表明該方法精密度良好。

1.3.2線性范圍的考察分別精密量取對照品溶液0.062 5、 0.125、 0.25、 0.75、 1.25、 1.75、 2.5 ml，分別置于5 ml容量瓶中，均加入環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻，配成25、 50、 100、 300、 500、 700、 1 000、 2 000 ng/ml濃度梯度標準液。按前述色譜條件測定，以峰面積(A)為縱坐標、濃度(C)為橫坐標，進行線性回歸。線性方程為A=149.56C+99 978(r=0.999 9)，三氯甲烷檢測濃度線性范圍25～2 000 ng/ml。

1.3.3檢測限與定量限試驗采用逐步稀釋法測得，以S/N=3時計算三氯甲烷的檢測限，以S/N=10時計算三氯甲烷的定量限。結果檢測限為1.50 ng/ml，折算成樣品的含量為1.50 ng/mg；定量限為4.62 ng/ml，折算成樣品的含量為4.62 ng/mg。

1.3.4重復性試驗和回收率試驗精密稱取已知三氯甲烷含量的樣品0.40 mg，分別置于棕色小瓶中，共3 份，分別加入400 μl的對照品液，于搖床浸泡萃取10 min，搖勻，按前述色譜條件測定及外標法計算， 三氯甲烷的平均回收率為98.35%， RSD=1.98%。結果顯示，重復性和回收率的RSD(%)值均小于2.0%，回收率在95.0～105.0%范圍內，說明該方法重復性和回收率良好。

1.4　供試品中三氯甲烷殘留量測定

取三氯甲烷和經(jīng)恒溫干燥箱25 ℃、37 ℃、60℃分別處理12、 24 h的6批樣品，按已知方法制備對照品溶液和供試品溶液，在前述色譜條件下測定，用外標法計算三氯甲烷的殘留量。

2　結　果

經(jīng)恒溫干燥箱25 ℃處理12、24 h的樣品中三氯甲烷的平均殘留量分別為1 918 ng/mg，RSD=2.8%； 1 428 ng/mg， RSD=4.0%。 經(jīng)恒溫干燥箱37 ℃處理12、 24 h的樣品中三氯甲烷的平均殘留量分別為1 207 ng/mg，RSD=2.2%； 724 ng/mg，RSD=2.6%。經(jīng)恒溫干燥箱60 ℃處理12、 24 h的樣品中三氯甲烷的平均殘留量分別為68.37 ng/mg， RSD=3.5%； 18.30 ng/mg， RSD=2.4%。 結果見表 1。結果表明：經(jīng)恒溫干燥箱60 ℃處理24 h的樣品中三氯甲烷的平均殘留量18.30 ng/mg低于國家限量60 ng/mg，保證臨床應用的安全性。

3　討　論

本實驗在溶劑選擇方面考察了乙酸乙酯、石油醚、環(huán)己烷三種溶劑對三氯甲烷的溶解性，其中溶劑為環(huán)己烷時，三氯甲烷含量最高，石油醚次之， 乙酸乙酯最低，且環(huán)己烷萃取所得供試品色譜圖雜質最少，基線最穩(wěn)定，故綜合考慮選用環(huán)己烷作為萃取溶劑。

目前,對殘留溶劑測定一般選擇火焰離子化檢測(FID)檢測器，可以得到較寬的線性范圍；但對含鹵族元素等電負性較強基團的殘留溶劑如三氯甲烷等，為提高檢測的靈敏度，可采用電子捕獲檢測器(ECD)檢測器[9]。因此，本實驗選擇能獲得較FID更高靈敏度的ECD檢測器。

表 1聚乳酸薄膜三氯甲烷殘留量測定結果

Tab 1Measurement result of trichloromethane residual amount in polylactic acid membrane

三氯甲烷保留時間(min)殘留量(ng/mg)平均殘留量(ng/mg)RSD(%)12h25℃2．1742．1772．17519681862192319182．824h25℃2．1752．1752．17714881374142314284．012h37℃2．1762．1732．17612311211117912072．224h37℃2．1752．1752．171　741　727　704　7242．612h60℃2．1832．1812．18468．4565．9270．7568．373．524h60℃2．1842．1842．18418．1418．8017．9518．302．4

干燥溫度及時間是影響聚乳酸薄膜制作中三氯甲烷殘留的兩個重要因素，樣品處理中考慮三氯甲烷的可揮發(fā)性，延長其揮發(fā)時間及提高溫度加快三氯甲烷的揮發(fā)，而若揮發(fā)時間過長溫度過高，樣品脆性加大韌性降低，無臨床實際應用意義[10]。故本實驗選擇在25、 37、 60 ℃恒溫干燥箱中進行12、 24 h處理。有相關研究表明石墨烯能提高聚乳酸薄膜的熱穩(wěn)定性和增強其力學性[11]，因此，后續(xù)優(yōu)化工藝時一方面可考慮加入相關物質以適當提高干燥溫度、延長干燥時間從而進一步降低三氯甲烷的殘留量；另一方面，改進工藝也可以考慮使用玉米淀粉或糖類發(fā)酵合成，通過擠出流涎成型法、吹塑成型法、熔融法等方法制成不含有毒物質的聚乳酸薄膜[12-14]。目前，已有使用納米技術，通過“乳化-溶劑揮發(fā)法”制成聚乳酸相關產(chǎn)品[15]。

本實驗通過方法學考察，該方法精密度良好，三氯甲烷檢測濃度在25～2 000 ng/ml范圍內線性關系良好，定量限為4.62 ng/ml，樣品測定重復性和回收率良好，表明該方法靈敏，準確。測定結果表明，所檢測樣品中最低為17.95 ng/mg低于國家藥典規(guī)定限度60 ng/mg，確保臨床應用安全。本課題組相關研究聚乳酸薄膜滿足口腔生物材料要求的生物功能性及相容性，本實驗驗證了樣品的安全性，為進一步應用于臨床提供可靠依據(jù)。

[1]Murariu M, Dubois P. PLA composites: From production to properties[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2016, 107: 17-46.

[2]鄒艷萍. 聚乳酸乳牙根管樁的生物相容性及臨床應用的實驗研究[D]. 西安: 第四軍醫(yī)大學, 2010.

[3]劉薇芝, 胡漢昆, 鄭保根, 等. 氣相色譜法測定磷酸二甲啡烷中有機溶劑殘留[J]. 中國藥師, 2014, 17(4): 563-565.

[4]黃華, 陳愛華, 周永明. 用于增強乳牙可吸收根管樁密閉的可吸收聚乳酸薄膜: 中國, CN103349797A[P]. 2013-10-16.

[5]侯玉妹, 黃華, 周永明. 聚乳酸可吸收薄膜對可吸收螺紋樁封閉性能的微滲漏研究[J]. 牙體牙髓牙周病學雜志, 2015, 25(10): 610-614.

[6]趙哲珊, 黃華, 邱榮敏, 等. 聚乳酸可吸收根管樁膜生物相容性實驗[J]. 華西口腔醫(yī)學雜志, 2016, 34(5):463-467.

[7]Chiu CH, Chou YC, Lin JP, et al. Chloroform Extract of Solanum lyratum Induced G0/G1 Arrest via p21/p16 and Induced Apoptosis via Reactive Oxygen Species, Caspases and Mitochondrial Pathways in Human Oral Cancer Cell Lines[J]. Am J Chin Med, 2015,43(7): 1453-1469.

[8]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(第三部)[M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2015: 67-72.

[9]陳汀波, 李棟, 仇萍, 等. 頂空氣相色譜-電子捕獲檢測器法測定正清風痛寧制劑原料中三氯甲烷的殘留量[J]. 藥物分析雜志, 2015, 35(9): 1645-1648.

[10]Douadji L, Benkhenafou F, Du WW, et al. Study the Micromechanical Behavior of PLA Film[J]. Adv Mater Res, 2013, 811(811): 23-27.

[11]陳志昌, 陳思浩, 王繼虎, 等. 石墨烯/聚乳酸復合膜的制備及其性能研究[J]. 材料導報, 2015, 29(22): 35-38.

[12]Van Wouwe P, Dusselier M, Vanleeuw E, et al. Lactide synthesis and chirality control for polylactic acid production[J]. Chem Sus Chem, 2016, 9(9): 907-921.

[13]范常秀. 聚乳酸復合材料制備及其性能研究[D]. 太原: 太原理工大學, 2013.

[14]徐睿杰, 雷彩紅, 蔡啟, 等. 聚乳酸薄膜及微孔膜研究進展[J]. 化工新型材料, 2015, 43(9): 36-38.

[15]沈鵬, 喬友備,馬瑞, 等. 包載 rhBMP-2和SDF-1的雙層納米微球的構建及體外釋藥研究[J]. 實用口腔醫(yī)學雜志, 2016, 32(2): 161-166.