腦蛋白水解物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷的修復(fù)作用及其胃漂浮片處方的優(yōu)化

楊昕祺，王廣紅，糜心雅，安麗萍，杜培革，王曼力

(北華大學(xué)長白山藥用動(dòng)植物活性多肽國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132013)

腦蛋白水解物 (brain protein hydrolyzate，BPH) 由動(dòng)物腦組織中提取分離所得，內(nèi)含小分子多肽、神經(jīng)營養(yǎng)因子和游離氨基酸等活性成分[1]。研究[2-3]顯示：BPH可跨過血腦屏障作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有增加腦活性、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受缺血、低氧和神經(jīng)毒素等損害的作用，并對(duì)神經(jīng)退行性疾病有良好療效。BPH中含有的肽類及氨基酸等有效物質(zhì)，在小腸中上部無菌部位通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)被小腸上皮細(xì)胞吸收，因此滯留時(shí)間越長吸收越好[4-5]。目前國內(nèi)外對(duì)BPH的劑型研究僅限于注射劑和片劑，劑型過于單一而常規(guī)片劑通過無菌部位時(shí)間僅為2～3 h，對(duì)多數(shù)口服制劑來說胃腸滯留時(shí)間相對(duì)過短，因此許多藥物未被釋放完全就已通過吸收部位，導(dǎo)致生物利用度不高，并且由于胃排空的個(gè)體差異較大，使某些藥物的藥效差異顯著[6-8]。本研究通過BPH在人工胃液、腸液處理后對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷修復(fù)作用的對(duì)比，制備BPH 胃漂浮片劑，觀察其胃腸滯留時(shí)間，并運(yùn)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化 BPH 胃漂浮片處方，為該成分的有效利用提供參考。

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器BPH (長春長慶藥業(yè))，BPH片 (黑龍江江世藥業(yè)有限公司)，PC12細(xì)胞(通派上海生物科技有限公司)，十八醇 (湖南爾康制藥股份有限公司，批號(hào)：105220140801)，羥丙甲纖維素HPMC-K4M (安徽山河藥用輔料股份有限公司，批號(hào)：F20072003)，聚丙烯酸樹脂Ⅱ (安徽山河藥用輔料股份有限公司，批號(hào)：F20090001)，乳糖 (曲阜市天利藥用輔料有限公司，批號(hào)：20110106)，硬脂酸鎂 (鄭州亨多寶化工有限公司，批號(hào)：G20130358)，微晶纖維素 (曲阜市天利藥用輔料有限公司，批號(hào)：20140305)，MTT (北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司,批號(hào)：51L10156 )，H2O2(沈陽市華東試劑廠，批號(hào)：20121009)，胎牛血清(天津市灝洋生物制品科技有限公司)。TDP-5 型單沖壓片機(jī) (長沙市云麓區(qū)中南制藥機(jī)械廠)，電熱恒溫水浴鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，MODEL LD310-2電子天平 (沈陽龍騰電子有限公司)，SY-6D 型片劑四用測(cè)定儀 (常州銳品精密儀器有限公司)，實(shí)驗(yàn)室微型噴霧干燥機(jī)L-117 (北京來亨科貿(mào)有限公司技術(shù)開發(fā)中心)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞由上海生物科技有限公司提供。PC12細(xì)胞采用含10% FBS 的 DMEM在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3BPH對(duì)正常PC12細(xì)胞的作用取對(duì)數(shù)生長期的PC12細(xì)胞(1.0×105mL-1)分為正常對(duì)照組和給藥組，另設(shè)空白對(duì)照組。正常對(duì)照組和給藥組每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，接種到96孔板中，空白對(duì)照組只加100 μL培養(yǎng)基，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。24 h后空白對(duì)照組、正常對(duì)照組每孔加入100 μL培養(yǎng)基，給藥組加入100 μL 不同濃度(20、40、60和120 mg·L-1) BPH，再培養(yǎng)24 h后加20 μL、0.5 g·L-1的MTT，培養(yǎng)2 h，去除培養(yǎng)液，各孔分別加入100 μL DMSO，37℃下孵育5 min，于酶標(biāo)儀550 nm 處測(cè)定吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=(給藥組A值-空白對(duì)照組A值)/(正常對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值)×100%。

1.4H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷模型的建立取對(duì)數(shù)生長期的PC12細(xì)胞分為正常對(duì)照組和模型組，另設(shè)空白對(duì)照組。正常對(duì)照組和模型組每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，空白對(duì)照組加100 μL培養(yǎng)基，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。24 h后向模型組加入梯度濃度(100、200、300、400和500 μmol·L-1)的H2O2溶液100 μL，空白對(duì)照組和正常對(duì)照組每孔加入培養(yǎng)基100 μL，采用MTT法，在1、2、3、4和5 h 時(shí)檢測(cè)A值，計(jì)算細(xì)胞活力。選擇細(xì)胞活力為65% 時(shí)的條件為最佳損傷條件。

1.5BPH在不同條件下對(duì)PC12細(xì)胞氧化損傷的作用取對(duì)數(shù)生長期的PC12細(xì)胞分為BPH組、人工胃液處理的BPH(GBPH) 組、人工腸液處理的BPH (IBPH)組、人工胃液處理的BPH片(GBPH-T) 組和人工胃液處理的BPH漂浮片(GBPH-FT) 組，接種到96孔板中，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液；另設(shè)空白對(duì)照組，只加100 μL培養(yǎng)基。24 h后空白對(duì)照組和正常對(duì)照組每孔加入100 μL培養(yǎng)基，其余各組加入以上處理的BPH 100 μL，濃度為20、40、60、80和100 mg·L-1，再培養(yǎng)24 h后用300 μmol·L-1的H2O2損傷3 h，采用MTT法于酶標(biāo)儀550 nm處檢測(cè)A值，計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力越高氧化損傷修復(fù)水平越高。

1.6BPH胃漂浮片的制備將BPH噴成固體粉末。十八醇在60℃ 熔融，加入丙烯酸樹脂Ⅱ號(hào)和HPMC-K4M質(zhì)量的2/3立即用16目篩制粒，剩余的HKMC-K4M與乳糖、微晶纖維素和BPH 濕法制粒。2次制得的粒混合后干燥，整粒，加0.3% 硬脂酸鎂，壓片。

1.7體外漂浮性能的觀察取6片放入 (37±0.5) ℃ 的人工胃液中，模擬胃蠕動(dòng)。記錄起漂時(shí)間與持續(xù)漂浮時(shí)間，觀察漂浮性。每片的起漂時(shí)間均 <5 s，持續(xù)漂浮時(shí)間 >8 h，說明漂浮性能良好。

1.9星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化工藝由預(yù)實(shí)驗(yàn)確定 BPH 20 mg、乳糖10 mg 和微晶纖維素 20 mg 為固定含量。十八醇 (X1)、HPMC-K4M (X2) 和丙烯酸樹脂Ⅱ號(hào) (X3) 質(zhì)量為考察因素，其 8 h 的累計(jì)釋放度為指標(biāo)，用 Design-expert 8.0.6 Trial 按水平編碼表進(jìn)行 3 因素 3 水平試驗(yàn)。模型擬合：根據(jù)顯著性 (P<0.05) 以及R2，優(yōu)選出二次模型方程為最佳擬合方程。并對(duì)其各項(xiàng)系數(shù)進(jìn)行方差分析。響應(yīng)面及優(yōu)化處方[10]：根據(jù)擬合方程，固定一個(gè)變量后對(duì)其余2個(gè)變量以 8 h 總釋放度對(duì)其影響做曲面圖和等高線圖。

1.10處方驗(yàn)證進(jìn)行 3 次平行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證最佳處方的可行性。比較8 h 總釋放度的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值。

2　結(jié)　果

2.1BPH 作用下各組 PC12 細(xì)胞活力與正常對(duì)照組比較，60 mg·L-1BPH組細(xì)胞活力明顯升高(121.17%±1.80%) (P<0.05)，120 mg·L-1BPH 組細(xì)胞活力時(shí)明顯降低(89.61%±1.70%)(P<0.05)。見圖1。

2.2H2O2作用下各組PC12細(xì)胞活力與正常對(duì)照組比較，300 μmol·L-1H2O2組損傷3 h時(shí)，細(xì)胞活力為 (65.37%±0.90%) (P<0.05)，為最佳條件，其他各組細(xì)胞活力均未達(dá)到65%。見圖2。

2.3各組PC12細(xì)胞氧化損傷修復(fù)水平與模型組比較，60 mg·L-1BPH 組和GBPH-FT 組細(xì)胞活力明顯升高 (P<0.01)，IBPH 組和GBPH組細(xì)胞活力升高 (P<0.05)；與BPH 組比較，IBPH 組細(xì)胞活力降低 (P<0.05)，GBPH組細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)；與GBPH-T 組比較，GBPH-FT 組細(xì)胞活力明顯升高 (P<0.05)。見表1。

*P<0.05 vs normal control group.

Fig.1Viabilities of PC12 cells in various groups detected by MTT assay

*P<0.05 vs normal control group.

Fig.2Viabilities of PC12 cells in various groups after treated with H2O2

2.4星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化工藝根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)水平編碼表和實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及曲面圖和等高線圖，t檢驗(yàn)在P<0.05 水平上簡化得到擬合方程：y=-1 170.295 15+31.173 45X1+6.522 81X2+28.428 72X3+0.047 361X1X2+0.048 359X1X3-0.114 51X2X3-0.261 82X12-0.148 85X22-0.101 81X32(R2=0.963 6)，F(xiàn)=20.60，P=0.000 3<0.05，表明該模型高度顯著，失擬度和擬合度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，有較高的可信度[11-12]?？捎闷鋵?duì) BPH 胃漂浮片的工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。通過對(duì)回歸模型方程計(jì)算，最大釋放率為85.437 7%；BPH 胃漂浮片最佳處方為HPMC-K4M27 mg，十八醇 63 mg，丙烯酸樹脂Ⅱ號(hào)13 mg，BPH 20 mg，乳糖 10 mg，微晶纖維素 20 mg，硬脂酸鎂 0.4 mg。水平編碼表見表 2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表 3，方差分析見表 4。曲面圖和等高線圖見圖3～5(插頁五)。

表1各組PC12 細(xì)胞活力

GroupCellviability(mg·L-1)020406080100Model65．37±0．90-----BPH-79．61±1．9883．69±3．27?96．37±1．78??87．10±3．14?82．47±3．56GBPH-73．23±2．1379．77±3．1689．43±2．64?81．56±2．2378．64±0．17IBPH-70．65±3．5474．68±1．8982．83±2．24?△77．45±1．6674．32±1．64GBPH?T-71．46±1．6476．15±4．6985．23±3．14?79．68±1．1676．65±2．13GBPH?FT-75．61±3．2580．35±0．6793．53±2．45??#83．93±4．3680．31±3．61

*P<0.05，**P<0.01vsmodel group；△P<0.05vsBPH group；#P<0.05vsGBPH-T group.“-”:No data.

2.5處方的驗(yàn)證藥物累積釋放度的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值偏差 < 5%，非常接近，BPH胃漂浮片漂浮滯后時(shí)間均<5 s，持續(xù)漂浮時(shí)間>8 h。見表5。

表2　實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表

表3效應(yīng)面法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.3Experimental results designed by effect surface method

TestnumberX1X2X3Cumulativerelease(η/%)1-11055．132-1-1052．67301-151．79400085．76500086．8360-1167．34700085．1681-1050．689-10-148．911000083．131100084．7612-10147．631310-150．761411066．781510156．711601155．67170-1-146．97

表4響應(yīng)面二次回歸方程方差分析

Tab.4Variance analysis of response surface quadratic regression equation

SourceofvarianceSSDFMFFPModel3741．339415．7020．600．0003A?X147．78147．782．370．1678B?X217．14117．140．850．3874C?X397．16197．164．810．0643X1X246．51146．512．300．1728X1X39．5819．580．470．5131X2X367．98167．983．370．1091X121182．2311182．2358．570．0001X22612．041612．0430．320．0009X321308．5511308．5564．830．0001Residual141．29720．18--Lackoffittest133．86344．6224．040．0051Pureerror7．4241．86-　-　Totalerror3882．6216---

“-”:No data.

表5處方 8 h 累積釋放度驗(yàn)證

Tab.5Verification of cumulative release of prescription for 8 h (Q8h)(η/%)

3　討　論

BPH 含有的成分具有修復(fù)腦神經(jīng)元的作用，能夠促進(jìn)腦蛋白合成和突觸形成，誘導(dǎo)神經(jīng)元分化進(jìn)而改善神經(jīng)元代謝，并可增加腦內(nèi)葡萄糖及氧的利用,促進(jìn)腦功能的恢復(fù)[13-14]。研究[15-16]表明：PC12 細(xì)胞源于生成神經(jīng)系統(tǒng)的外胚層，具有某些神經(jīng)元的特征，是比較理想的細(xì)胞模型，主要用于評(píng)價(jià)各類藥物對(duì)神經(jīng)元氧化損傷的影響。因此本研究選用 PC12 細(xì)胞并建立H2O2對(duì)PC12細(xì)胞氧化損傷模型，結(jié)果表明：在 60 mg·L-1濃度時(shí)BPH 不僅對(duì)正常 PC12細(xì)胞有很好的增殖作用，而且對(duì)損傷細(xì)胞有明顯的修復(fù)作用，同時(shí)與人工腸液相比，人工胃液環(huán)境處理的BPH的修復(fù)作用與BPH對(duì)損傷細(xì)胞修復(fù)作用最為接近，證明BPH在胃環(huán)境下可以穩(wěn)定存在，使BPH胃漂浮片劑的研制成為可能。

BPH 相對(duì)分子質(zhì)量小并易被腎小球?yàn)V過，導(dǎo)致體內(nèi)循環(huán)的半衰期過短，這樣不僅達(dá)不到療效還需要多次注射給藥才能穩(wěn)定藥效，造成治療成本高并且患者順應(yīng)性差[17]。而本文作者研制的 BPH 胃漂浮片劑可以充分延長胃滯留時(shí)間，從而提高小腸上皮細(xì)胞吸收藥物，釋放的藥物以溶液狀態(tài)大量到達(dá)無菌部位，通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)跨越生物膜，促進(jìn)細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)功能，能很好地提高生物利用度，從而減少多次給藥降低治療成本并提高患者順應(yīng)性，在神經(jīng)退行性疾病治療中具有較強(qiáng)的應(yīng)用潛力。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法在藥學(xué)領(lǐng)域是新型的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)次數(shù)少且精確度高，能科學(xué)有效處理處方輔料因素的影響[18]。根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法擬合方程 (P<0.05，R2=0.963 6)，模型顯著性及擬合度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，方差分析結(jié)果顯示：十八醇是影響漂浮片的體外釋放的最顯著因素，HPMC-K4M和丙烯酸樹脂Ⅱ號(hào)分別次之。制成的漂浮片可持續(xù)漂浮 8 h，充分延長了胃內(nèi)滯留時(shí)間，體外釋放率可達(dá) 85.437 7%，釋放充分而且藥效與 BPH 片對(duì)比能得到更好的利用。與BPH 片比較，研制成的漂浮片劑與在人工胃環(huán)境中能更好地抑制 H2O2引起的 PC12 細(xì)胞活力降低。

處方中 HPMC-K4M 在漂浮片中含量越少, 漂浮片的密度越低、十八醇密度較低、質(zhì)量小,且越多在水中越呈不溶性, 在 HPMC-K4M 形成的凝膠體制中, 一定程度上起助漂作用[19]；丙烯酸樹脂Ⅱ號(hào)可用于增加藥物的穩(wěn)定性，改變藥物的釋放性能[20]；乳糖作為致孔劑并有水溶性，可增加藥物的緩釋作用[21]。本實(shí)驗(yàn)為今后的 BPH 活性探討及其胃漂浮制劑處方優(yōu)化和輔料研究等提供了參考。

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