水流動力學(xué)注射對小鼠肝損傷及肝臟的自然修復(fù)作用

李勝男，張海英，孫千惠，李艷茹，葛　鶴，杜　瑜，王　琳

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系 病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 吉林 長春 130021)

水流動力學(xué)注射(hydrodynamic injection)是將大體積(占小鼠體質(zhì)量的8%～10%)質(zhì)粒DNA溶液經(jīng)小鼠尾靜脈在5～8 s內(nèi)快速注射入小鼠體內(nèi)，進(jìn)而獲得轉(zhuǎn)基因表達(dá)的方法，通常轉(zhuǎn)基因在肝臟表達(dá)最多[1]。除DNA外，已成功應(yīng)用此方法將RNA、蛋白甚至病毒等轉(zhuǎn)移到動物體內(nèi)，廣泛應(yīng)用于基因功能測試、基因治療等研究以及病毒性肝炎模型的制備等[2-3]。由于靜脈注射的大體積質(zhì)粒DNA溶液迅速進(jìn)入體循環(huán)，使心臟負(fù)荷過重，導(dǎo)致大量的液體淤積在肝臟，肝內(nèi)壓力升高，迫使肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗增大，肝細(xì)胞膜出現(xiàn)暫時性小孔，質(zhì)粒DNA進(jìn)入肝細(xì)胞，進(jìn)而表達(dá)目的基因[4]。此方法產(chǎn)生的壓力將基因送入肝細(xì)胞的同時，也可能引起肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞損傷。但是關(guān)于肝臟的形態(tài)學(xué)改變的研究[5]極少，其修復(fù)過程尚不清楚。本研究通過水流動力學(xué)注射法制備小鼠肝損傷模型，觀察肝臟在損傷及修復(fù)過程中的形態(tài)學(xué)變化，檢測與修復(fù)有關(guān)的因子，為更好地利用此方法進(jìn)行科學(xué)研究提供依據(jù)，為進(jìn)一步探討水流動力學(xué)注射性肝損傷的修復(fù)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物和肝損傷模型制備31只雌性Balb/c小鼠，體質(zhì)量為18～20 g，購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號：SCXK(吉)-2003-0001。用26 G針頭將小鼠體質(zhì)量10%的生理鹽水(1.8～2.0 mL)在3 s內(nèi)經(jīng)尾靜注射入小鼠體內(nèi)。按照注射后時間點(diǎn)將小鼠分為5組：30 min組、8 h組、1 d組、3 d組和7 d組，每組5只。以6只未注射小鼠為對照組，記為0 min組。

1.2各組小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase，ALT)測定注射生理鹽水后，于不同時間點(diǎn)經(jīng)內(nèi)眥靜脈取血，按照ALT試劑盒(上?？迫A-東菱診斷用品公司)說明檢測血清ALT水平。

1.3肝臟形態(tài)學(xué)觀察分別于注射后不同時間點(diǎn)處死小鼠并稱體質(zhì)量。取肝臟觀察大體改變，制備石蠟切片，經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察病理學(xué)改變。為了確定肝臟病理學(xué)改變的區(qū)域，根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]將圍繞門靜脈周圍的肝細(xì)胞區(qū)域定為門靜脈區(qū)，即1區(qū)；圍繞在中央靜脈周圍的肝細(xì)胞區(qū)域定為中央靜脈區(qū)，即3區(qū)；介于二者之間的肝細(xì)胞區(qū)域?yàn)?區(qū)。每只小鼠分別選取10個有代表性的區(qū)域，統(tǒng)計每高倍視野下的肝細(xì)胞數(shù)及雙核細(xì)胞數(shù)。

1.4免疫組織化學(xué)染色上述制備的石蠟切片，利用免疫組織化學(xué)染色(SP法)觀察增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的表達(dá)情況。一抗為鼠抗人PCNA單克隆抗體(福州邁新，1∶300)，二抗為羊抗鼠/兔IgG(福州邁新)，DAB溶液顯色，蘇木精復(fù)染。以PBS代替一抗作為陰性對照。PCNA陽性表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕黃色。每只小鼠肝組織切片內(nèi)分別選取10個視野，計算肝細(xì)胞及膽管細(xì)胞PCNA陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，將其作為PCNA指數(shù)。

1.5Real-time PCR法檢測基因表達(dá)水平按照RNAiso Plus(日本TaKaRa公司)說明書提取肝組織總RNA；根據(jù)Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(日本TaKaRa公司)說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)，按照FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (瑞士Roche公司)說明書進(jìn)行Real-time PCR法檢測，利用ABI 7300實(shí)時熒光定量PCR儀(美國 ABI公司)檢測各組小鼠肝組織中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α(transforming growth factor-α，TGF-α)、Cyclin D1、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平，基因相對表達(dá)水平以2-ΔΔCt表示，其中ΔΔCt=(實(shí)驗(yàn)組Ct目的基因-實(shí)驗(yàn)組Ct內(nèi)參基因) -(對照組Ct目的基因-對照組Ct內(nèi)參基因)。以m-Arbp和β-actin為內(nèi)參，引物設(shè)計見表1。

表1　引物序列

2　結(jié)　果

2.1各組小鼠肝臟大體改變和血清ALT水平水流動力學(xué)注射后，小鼠抽搐、呼吸急促，數(shù)秒鐘后恢復(fù)正常；體質(zhì)量增加約10%，8 h后體質(zhì)量恢復(fù)。與對照組(0 min組)比較，30 min組小鼠肝質(zhì)量/初始體質(zhì)量比無明顯變化，8 h組明顯下降(P<0.05)，1 d 組和7 d組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。對照組小鼠肝臟呈灰白色，表面無出血點(diǎn)；30 min組小鼠肝臟呈灰紅色；8 h組小鼠肝臟表面出現(xiàn)黑紅色片狀出血區(qū)；1 d組小鼠肝臟表面仍可見片狀出血區(qū)；3 d組小鼠出血區(qū)面積減??；7 d組小鼠肝臟呈灰白色，與對照組相似。見圖1(插頁四)。30 min組和8 h組小鼠血清ALT水平明顯低于對照組(P<0.01)，1 d組明顯高于對照組(P<0.01)，7 d組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2各組小鼠肝質(zhì)量/初始體質(zhì)量比值和血清ALT水平

GroupRatioofliverweight/originalbodyweightALT[λB/(U·L-1)]Control　(0min)0．064±0．01027．00±2．9630min0．065±0．0063．40±1．82??8h0．049±0．005?3．00±1．58??1d0．064±0．005250．50±62．69??3d0．063±0．00347．80±7．397d0．077±0．00529．20±5．26

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group.

2.2肝組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)對照組(0 min組)小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心，沿肝細(xì)胞索呈放射狀排列，肝竇清晰。30 min組小鼠出現(xiàn)大量腫脹的肝細(xì)胞，胞質(zhì)淡染，成群分布，主要位于1區(qū)和2、3區(qū)之間；此外，腫脹區(qū)域內(nèi)可見小面積出血，肝細(xì)胞索被破壞；每高倍視野下肝細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組(q=4.760，P<0.05)。見圖2(插頁五)和表3。8 h組小鼠腫脹細(xì)胞數(shù)量較30 min組明顯減少，而出血更加明顯，肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞被破壞，可見紅細(xì)胞進(jìn)入腫脹的肝細(xì)胞內(nèi)，在出血壞死灶周圍未受損區(qū)域內(nèi)可見雙核肝細(xì)胞及核分裂象(圖2，見插頁五)；與30 min組比較，肝細(xì)胞數(shù)明顯增多(q=7.310，P<0.01)，雙核細(xì)胞數(shù)也明顯增多(q=7.200，P<0.01)。1 d組出血壞死灶面積減小(圖2，見插頁一)，肝細(xì)胞數(shù)明顯少于8 h組(q=4.966，P<0.05)，雙核細(xì)胞數(shù)也明顯少于8 h組(q=6.596，P<0.01)，但是二者與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。3 d組除靠近肝臟表面處有個別出血灶外，肝實(shí)質(zhì)內(nèi)出血壞死灶基本消失，肝細(xì)胞數(shù)及雙核細(xì)胞數(shù)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。7 d組肝組織結(jié)構(gòu)與對照組相似，肝細(xì)胞、雙核細(xì)胞數(shù)量與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。所有時間點(diǎn)均未見膽管上皮細(xì)胞的破壞。

表3每高倍視野下各組小鼠肝組織內(nèi)細(xì)胞數(shù)量

GroupNo．ofhepatocytesNo．ofbinuclearhepatocytesControl(0min)78．5±7．69．4±3．230min65．4±10．0?7．6±2．68h88．0±9．7△15．2±3．3△1d71．4±2．0#7．8±0．9##3d78．0±3．76．7±0．67d77．4±3．37．6±0．7

*P<0.05vscontrol group;△P<0.01vs30 min group;#P<0.05,##P<0.01vs8 h group.

2.3各組小鼠肝組織PCNA表達(dá)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：PCNA陽性肝細(xì)胞主要位于2、3區(qū)受損區(qū)域周圍。8 h組PCNA指數(shù)較對照組升高(t=4.458,P<0.01)，1 d組最高，且明顯高于對照組(t=15.557,P<0.01)，7 d組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。30 min組匯管區(qū)膽管細(xì)胞PCNA指數(shù)明顯高于對照組(t=3.985,P<0.01)，隨后降低，7 d組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

2.4各組小鼠肝組織中多種因子的表達(dá)30 min組小鼠肝組織中TNF-α mRNA水平明顯高于8 h組(q=4.952，P<0.05)；8 h組仍高于7 d組(q=8.461，P<0.01)。30 min組小鼠肝組織中IL-6 mRNA水平明顯高于8 h組(q=14.750，P<0.01)，8 h組明顯高于7 d組(q=6.923，P<0.01)。30 min組各組小鼠肝組織中EGF mRNA 水平明顯高于8 h組(q=14.750，P<0.01)。3 d組各組小鼠肝組織中HGF mRNA 水平明顯高于30 min 組和8 h組(q=5.031，P<0.05；q=4.631，P<0.05)。8 h組和3 d組TGF-α mRNA水平均明顯高于30 min 組(q=4.592，P<0.05；q=8.137，P<0.01)。8 h和1 d組Cyclin D1 mRNA水平均明顯高于7 d組(q=4.736，P<0.05；q=5.213，P<0.05)。30 min組各組小鼠肝組織中VEGF mRNA水平明顯高于8 h組(q=13.551，P<0.01)。1 d組Bax/Bcl-2 mRNA 比值明顯高于30 min組(q=5.731，P<0.01)。見表4。

3　討　論

肝再生主要是由殘存的健康成熟肝細(xì)胞通過增殖完成[6]，除肝細(xì)胞外，膽管細(xì)胞能夠通過TNF-α、IL-6和VEGF等因子的釋放對組織損傷做出反應(yīng)，并在上述因子的調(diào)節(jié)下，進(jìn)行與膽管修復(fù)有關(guān)的增殖、凋亡以及血管生成[7]。另外，Kupffer細(xì)胞、肝星形細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞可通過分泌多種細(xì)胞因子而參與肝再生，如TNF-α、IL-6以及VEGF等[8]。本實(shí)驗(yàn)中，注射后30 min，肝細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組，這是由于此時肝細(xì)胞腫脹、體積增大，導(dǎo)致單位面積內(nèi)細(xì)胞數(shù)減少所致[5]；注射后8 h肝細(xì)胞數(shù)以及雙核細(xì)胞數(shù)明顯多于30 min，肝細(xì)胞PCNA指數(shù)也明顯高于30 min，這些增多的肝細(xì)胞可能是為了維持肝臟功能而產(chǎn)生。注射后8 h，出現(xiàn)彌漫的片狀出血壞死灶，說明此時肝竇內(nèi)皮細(xì)胞受到破壞，但是在注射后7 d，出血壞死消失，肝組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常。膽管細(xì)胞PCNA指數(shù)在注射后30 min高于其他時間點(diǎn)。以上結(jié)果說明：在水流動力學(xué)注射引起的肝損傷中，肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞均參與了肝組織修復(fù)。

圖3　各組小鼠肝組織PCNA指數(shù)

Fig.3PCNA indexes in liver tissue of mice in various groups

表4各組小鼠肝組織中肝再生相關(guān)因子的mRNA相對表達(dá)水平

GroupTNF?αIL?6EGFHGFTGF?αCyclinD1VEGFBax/Bcl?230min3．43±1．1813．45±3．091．81±0．470．39±0．080．42±0．121．28±0．252．05±0．110．50±0．178h1．48±0．40?1．36±0．32??0．93±0．28??0．42±0．240．88±0．27?1．82±0．650．69±0．28??0．94±0．421d0．68±0．140．95±0．411．00±0．080．48±0．180．82±0．282．02±0．851．00±0．231．36±0．38??3d0．60±0．170．57±0．230．97±0．260．84±0．31?△1．52±0．75??1．29±0．72#1．37±0．190．80±0．287d0．40±0．15△△0．46±0．07△△0．88±0．440．74±0．100．79±0．170．77±0．37△#1．17±0．140．68±0．32

*P<0.05,**P<0.01vs30 min group;△P<0.05,△△P<0.01vs8 h group;#P<0.01vs1 d group.

本實(shí)驗(yàn)中，小鼠在水流動力學(xué)注射后30 min及8 h肝組織出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹、肝細(xì)胞壞死及出血，因肝細(xì)胞壞死導(dǎo)致8 h 時肝質(zhì)量/初始體質(zhì)量比下降，ALT釋放入血，但是因?yàn)轶w內(nèi)注射了大量的液體，導(dǎo)致ALT濃度被稀釋，使測得的30 min及8 h組血清ALT值明顯低于對照組。注射后8 h，肝組織壞死的同時，肝細(xì)胞開始大量增殖，表現(xiàn)為肝細(xì)胞(含雙核肝細(xì)胞)數(shù)量增加。1 d時，注射的液體已經(jīng)被機(jī)體排出，1 d組小鼠血清ALT達(dá)到峰值，此時肝組織內(nèi)出血、壞死灶明顯減少，肝質(zhì)量/初始體質(zhì)量比也恢復(fù)到對照組水平，肝細(xì)胞數(shù)也與對照組相似。到注射后3 d，ALT水平、肝細(xì)胞數(shù)、PCNA指數(shù)均與對照組無差別，肝臟組織結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常。這與Budker等[5]的研究結(jié)果基本一致，即損傷快速出現(xiàn)、快速消退。

目前研究[9]認(rèn)為：急性肝損傷時肝臟的再生是一個快速發(fā)生的過程，主要包括啟動期、增殖期和終止期。在啟動階段，有多種細(xì)胞因子和生長因子參與調(diào)控，其中TNF-α和IL-6使肝細(xì)胞由G0期進(jìn)入G1期。在四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝損傷模型中，TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平在CCl4處理后1 d最高；使用TNF-α抗體或者敲除TNF-α受體(TNFR1)導(dǎo)致TNF-α耗盡或缺失均會引起肝再生障礙，并且這與NF-κB和STAT3活化受阻從而不能誘導(dǎo)IL-6的表達(dá)有關(guān)[8]。肝切除后，TNF-α與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，尤其是Kupffer細(xì)胞的受體結(jié)合，激活NF-κB信號通路產(chǎn)生IL-6，IL-6與肝細(xì)胞上的IL-6受體結(jié)合，激活肝細(xì)胞內(nèi)STAT3以及ERK1/2信號通路，隨后進(jìn)行DNA復(fù)制，完成肝再生[10]。TNF-α和EGF聯(lián)合可促進(jìn)肝再生過程中的DNA復(fù)制。在增殖階段，HGF、TGF-α和EGF等促有絲分裂原可通過 Ras-MAPK 和PI3K/AKT信號通路促進(jìn)肝細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞增殖[8]。EGF與EGFR結(jié)合后，通過促進(jìn)Cyclin D1表達(dá)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞增殖[11]。VEGF能夠促進(jìn)血管生成。在肝切除模型中，VEGF可以通過肝竇內(nèi)皮細(xì)胞增殖，重建肝竇，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。Bockhorn等[12]研究發(fā)現(xiàn)：肝切除后24 h，VEGF處理組肝細(xì)胞增殖極高，而VEGF抗體處理組肝細(xì)胞增殖幾乎被完全抑制；VEGF通過與VEGFR結(jié)合刺激肝竇內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并釋放IL-6和HGF，從而參與肝臟的修復(fù)。凋亡在肝臟的再生和終止階段發(fā)揮作用[13-15]。

本實(shí)驗(yàn)中，注射后30 min時TNF-α、IL-6、EGF和VEGF mRNA表達(dá)水平明顯升高，而Bax/Bcl-2比值較低。8 h時TNF-α和IL-6仍很高，此時Cyclin D1 也升高。1 d時Cyclin D1和Bax/Bcl-2比值較高，3 d時HGF和TGF-α水平較高。本文作者推測：在水流動力學(xué)注射造成肝損傷后，快速升高的TNF-α和IL-6啟動了修復(fù)的過程，使肝細(xì)胞從G0期進(jìn)入G1期；EGF通過Cyclin D1使肝細(xì)胞進(jìn)入增殖階段，VEGF促進(jìn)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞增殖和肝竇的修復(fù)；而后期的修復(fù)停止，可能是由促凋亡的Bax基因以及HGF和TGF-α共同發(fā)揮作用完成的。

綜上所述，水流動力學(xué)注射可引起急性肝損傷，主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹并形成出血、壞死灶，肝損傷后可迅速啟動修復(fù)過程，損傷可在1周左右通過細(xì)胞增殖自然修復(fù)；與肝再生有關(guān)的多種細(xì)胞因子和生長因子參與修復(fù)過程，但是具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

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