木葡聚糖基溫敏水凝膠預(yù)防大鼠腹壁-腸壁再粘連及其對局部TGF-β1和CTGF表達的影響

孫　紅，李碩峰，崔　菁，張二帥，李景武，熊艷杰，馬麗桃，姚芳蓮，車鵬程

(1.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河北省慢性病重點實驗室 唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點實驗室，河北 唐山 063210；2.天津大學(xué)化工學(xué)院高分子科學(xué)與工程系，天津 300350；3.河北省唐山市人民醫(yī)院腹盆外科，河北 唐山 063001；4.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，河北 唐山 063000)

臨床上對于既已形成的粘連多采用粘連松解手術(shù)進行分離，但對粘連組織分離的同時又會造成新的創(chuàng)傷，粘連松解術(shù)后再粘連的發(fā)生率高達50%，因此對于粘連松解術(shù)后預(yù)防再粘連的研究具有非常重要的臨床意義[1-2]。目前預(yù)防術(shù)后粘連的方法大多針對于普通腹腔外科手術(shù)后引起的粘連[3-4]，對于粘連機制更加復(fù)雜的粘連松解術(shù)后再次粘連的預(yù)防效果尚不清楚。研究[5-7]顯示:聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-聚乙二醇(PEG-PCL-PEG)溫敏凝膠在大鼠腹壁-盲腸缺損模型中均取得了良好的防粘連效果，然而在大鼠腹壁盲腸粘連松解術(shù)后的二次損傷模型中卻未能有效地預(yù)防再次粘連的發(fā)生。

本文作者前期研究[8]表明：木葡聚糖基(mXG)溫敏水凝膠具有可逆的“低溫溶膠，體溫凝膠”溫敏行為，有很好的細胞相容性，對普通手術(shù)后的腹腔粘連有優(yōu)異的防粘連效果。4% mXG溶液溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度為23℃，在37℃下凝膠過程在3 min內(nèi)即可完成，并且有較高的凝膠強度，因此本文作者推測其對預(yù)防粘連松解術(shù)后再粘連的發(fā)生可能也具有一定的效果。本研究在以往工作的基礎(chǔ)上，進一步評價mXG溫敏水凝膠對成纖維細胞的抗黏附性能，并構(gòu)建粘連松解術(shù)后再次粘連動物模型，在此基礎(chǔ)上評價mXG溫敏水凝膠對于粘連松解術(shù)后再粘連發(fā)生的預(yù)防效果及對轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)表達的影響，旨在為解決粘連松解術(shù)后再粘連這一臨床難題提供新的治療方法。

1　材料與方法

1.1實驗動物、細胞和主要試劑健康雄性SD大鼠55只，由華北理工大學(xué)動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK(京)2004-0004。所有大鼠在溫度(22±2)℃、相對濕度(50±5)%環(huán)境下單籠飼養(yǎng)，期間提供充足的水和飼料，實驗前保證至少1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，術(shù)前12 h禁食。帶有綠色熒光的L929鼠成纖維細胞(3T3 小鼠胚胎成纖維細胞)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供。mXG溫敏水凝膠由天津大學(xué)化工學(xué)院合成，醫(yī)用殼聚糖防粘連膜粘停寧為煙臺萬利醫(yī)用品有限公司產(chǎn)品，TGF-β1和CTGF多克隆抗體為Affinity公司產(chǎn)品，免疫組織化學(xué)通用二抗PV6000為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，Van Gieson為珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，RPMI-1640和胎牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品。

1.2mXG溫敏水凝膠抗細胞黏附性能檢測將0.2 mL 4%mXG溶液加入48孔培養(yǎng)板中，移至37℃孵育1 h，使其完全凝膠。在每孔中加入1 mL含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，將含有綠色熒光標記的L929鼠成纖維細胞以1×104mL-1密度、在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以直接在孔板中培養(yǎng)的細胞作為對照。培養(yǎng)48 h后，熒光顯微鏡下觀察凝膠表面細胞的數(shù)量和形態(tài)。

1.3大鼠腹壁-盲腸粘連松解術(shù)后再次粘連模型建立制作腹壁1 cm×2 cm大小、深約1 mm的創(chuàng)面；在與腹壁創(chuàng)面相對應(yīng)的盲腸表面使用手術(shù)刷輕輕磨擦直到盲腸漿膜層被破壞至有明顯的點狀出血，將盲腸和腹壁表面懸吊縫合，使盲腸創(chuàng)面和腹壁創(chuàng)面相對合以確保粘連形成。術(shù)后7 d，鈍性分離粘連組織，創(chuàng)面摩擦處理至有明顯的滲血，連續(xù)縫合關(guān)腹。常規(guī)肌肉注射消炎藥。為了驗證模型的有效性，二次術(shù)后第7天處死大鼠，再次開腹驗證粘連松解術(shù)后再次粘連的情況。

1.4mXG水凝膠對粘連松解術(shù)后再次粘連效果的評價在一次損傷后發(fā)生粘連的大鼠中選擇48只粘連評分接近的實驗動物，對其實施粘連松解手術(shù)，隨機分為3組(n=16)：再粘連組、商業(yè)膜組和mXG水凝膠組。再粘連組在關(guān)腹前將1 mL生理鹽水注射于大鼠腹壁和盲腸的創(chuàng)面；商業(yè)膜組將2 cm× 3 cm大小的醫(yī)用殼聚糖防粘連膜粘停寧覆蓋于大鼠腹壁創(chuàng)面后關(guān)腹；mXG水凝膠組將1 mL 4% mXG溫敏水凝膠注射至大鼠腹壁和盲腸的創(chuàng)面，待凝膠完全形成后關(guān)腹。術(shù)后第7和14天分別處死各組大鼠8只，并按照以下評分標準對粘連程度進行評分[9]：0分，完全無粘連；1分，腹腔內(nèi)有一處薄的粘連；2 分，有不止一處的疏松粘連；3 分，有比較致密的粘連；4 分，有不止一處的致密粘連；5 分，廣泛而致密的血管化粘連。對于粘連發(fā)生的區(qū)域，切取腹壁-盲腸粘連區(qū)域的組織；對于未粘連的區(qū)域，分別切取腹壁和盲腸的創(chuàng)面組織，固定、包埋，連續(xù)切片行HE染色、Van Gieson染色和免疫組織化學(xué)染色，觀察TGF-β1和CTGF表達情況， TGF-β1陽性細胞為細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒，CTGF陽性細胞為細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒。

2　結(jié)　果

2.1mXG溫敏水凝膠內(nèi)L929鼠成纖維細胞的粘附性能再粘連組中可見大量L929鼠成纖維細胞貼壁生長，呈細長的梭形并有偽足形成；在mXG溫敏水凝膠組mXG溫敏水凝膠表面僅有非常少的細胞，由于不能很好地貼壁，這些細胞大都呈圓球狀。見圖1(插頁一)。

2.2腹壁-腸壁粘連松解術(shù)后再次粘連的形態(tài)表現(xiàn)為了驗證模型的有效性，二次手術(shù)后第7天處死大鼠，再次開腹驗證粘連松解術(shù)后再次粘連的情況，所有經(jīng)粘連松解術(shù)后再次損傷的大鼠腹壁與盲腸間均發(fā)生了嚴重的粘連，證明了腹壁-盲腸粘連松解術(shù)后再損傷粘連模型的有效性和穩(wěn)定性。見圖2(插頁二)。

2.3再粘連術(shù)后粘連程度評分根據(jù)評分標準對各組大鼠術(shù)后粘連情況進行評分和統(tǒng)計，結(jié)果如表1所示。在再粘連組，術(shù)后第7天所有大鼠均發(fā)生了4～5分的嚴重粘連，第14天多數(shù)大鼠形成了5分粘連。在商業(yè)膜組，術(shù)后第7天時的粘連主要集中在3～4分，而在第14天時多數(shù)均形成4～5分的粘連，商業(yè)膜組粘連評分與再粘連組接近，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在mXG溫敏水凝膠組，多數(shù)大鼠均未發(fā)生粘連，少數(shù)幾只大鼠發(fā)生粘連，但僅是1分的輕度粘連；mXG溫敏水凝膠組粘連評分低于再粘連組(P<0.05)。

表1術(shù)后第7和14天各組大鼠損傷部位粘連評分

GroupAdhesionscore(t/d)　　714Adhesion4．25±0．464．88±0．35Commercial　membrane3．50±0．934．10±0．76mXGhydrogel0．13±0．35?△0．25±0．46?△

*P<0.05vsadhesion group;△P<0.05 compared with commerial membrane group.

2.4再粘連術(shù)后第7天組織病理學(xué)表現(xiàn)術(shù)后第7天的組織學(xué)結(jié)果顯示：再粘連組漿膜層連續(xù)性中斷，纖維結(jié)締組織增生情況嚴重，有大量中性粒細胞及巨噬細胞；商業(yè)膜組漿膜層連續(xù)，增生的結(jié)締組織厚度低于再粘連組，但膠原纖維較致密。mXG組盲腸和腹壁創(chuàng)面恢復(fù)平整，但纖維結(jié)締組織增生較多，且可見纖維組織中包裹著未降解的凝膠團。在再粘連組和商業(yè)膜組中，腹壁和盲腸間存在明顯的粘連區(qū)域(虛線內(nèi))，這一區(qū)域在Van Gieson特殊染色中被特異性地染成紅色。見圖3(插頁二)。

2.5再粘連術(shù)后第14天組織病理學(xué)表現(xiàn)術(shù)后第14天組織學(xué)結(jié)果顯示：再粘連組的粘連區(qū)域膠原纖維沉積明顯增多，粘連變得更為致密，部分區(qū)域可以觀察到有新生血管的出現(xiàn)，而且粘連區(qū)域的厚度相對于第7天時也有所增加；商業(yè)膜組粘連區(qū)域的厚度未見明顯增加，但粘連組織相對于第7天時變得更加規(guī)整和致密，而且部分區(qū)域有新生血管的出現(xiàn)；與第7天時比較，mXG溫敏水凝膠組第14天時腹壁創(chuàng)面組織中的炎性細胞明顯減少，未見凝膠的殘留，新生間皮層下原來存在的纖維蛋白沉積物在纖維蛋白溶解酶系統(tǒng)的作用下也逐漸地被降解和吸收，愈合后的組織變薄。盲腸的愈合情況與腹壁類似，但仍可見少量的纖維包裹的殘留凝膠。見圖4(插頁二)。

2.6再粘連術(shù)后TGF-β1和CTGF表達情況術(shù)后第7天，再粘連組與商業(yè)膜組在巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞及鄰近的成纖維細胞中可見TGF-β1和CTGF呈強陽性表達；mXG組TGF-β1和CTGF陽性表達則較弱，陽性部位為組織內(nèi)血管內(nèi)皮細胞胞漿。術(shù)后第14天，再粘連組與商業(yè)膜組TGF-β1和CTGF表達呈彌漫陽性表達，主要在成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞胞漿；mXG組細胞排列整齊，在結(jié)締組織內(nèi)TGF-β1主要表達于成纖維細胞。各組TGF-β1和CTGF的表達情況與大體觀察、HE和Van Gieson染色結(jié)果一致。見圖5和6(插頁二)。

3　討　論

術(shù)后粘連是腹部手術(shù)引起的一種后遺癥，輕者影響腸道的運動功能，導(dǎo)致腹痛和腹脹等癥狀，重者出現(xiàn)腸梗阻乃至腸壞死。普通腹部外科手術(shù)后腹部粘連發(fā)生率為76%[10]。粘連松解術(shù)后再次粘連的情況不容忽視，然而對于預(yù)防粘連松解術(shù)后再次粘連的研究國內(nèi)少有報道，作為這一研究的基礎(chǔ)，成功構(gòu)建粘連松解術(shù)后再次粘連動物模型尤為重要。本研究實驗結(jié)果表明經(jīng)粘連松解術(shù)后再次損傷的動物腹壁與盲腸間均發(fā)生了嚴重的粘連，建立了粘連松解術(shù)后再次粘連動物模型，在該模型有效性和穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，研究和開發(fā)能夠有效預(yù)防粘連松解術(shù)后再次粘連的材料具有重要的臨床意義。

溫敏水凝膠由于兼具液態(tài)類材料的操作便利性和固態(tài)類材料的物理屏障性，并能結(jié)合微創(chuàng)療法，在術(shù)后防粘連領(lǐng)域得到了廣泛的關(guān)注。Yang等[11]新近報道一種新型光誘導(dǎo)亞胺交聯(lián)水凝膠—CNG hydrogel,該水凝膠便于術(shù)中操作使用，有很好的生物相容性，易于降解。Chen等[12]報道了含透明質(zhì)酸與殼聚糖的可注射溫敏水凝膠，有良好的預(yù)防腹腔粘連的效果，但缺乏對粘連松解術(shù)后再次粘連的研究報道。因此研究和開發(fā)能夠有效預(yù)防粘連松解術(shù)后再次粘連的材料，具有重要的臨床意義。

本課題組前期利用綠色酶解反應(yīng)制得了具有反向溫敏行為的mXG溫敏水凝膠，基于mXG的可注射性、良好的生物相容性及生物可降解性，首次將其應(yīng)用于術(shù)后防粘連的研究中，在注射至腹壁和盲腸的創(chuàng)面后能夠快速地原位形成具有較高強度的凝膠，并且能夠在原位維持較好的完整性，所以其能夠在粘連形成的關(guān)鍵時期有效地將腹壁和盲腸的創(chuàng)面進行隔離，避免了創(chuàng)面的相互接觸而形成粘連，不僅提高了手術(shù)操作的便利性，而且在SD大鼠腹壁-盲腸損傷模型中取得了良好的預(yù)防術(shù)后粘連的效果[8]。

成纖維細胞和膠原纖維在創(chuàng)面的沉積是導(dǎo)致術(shù)后粘連形成的關(guān)鍵因素[13]。成纖維細胞在粘連的形成過程中起著非常重要的作用，因此如果能夠有效地阻抗成纖維細胞的黏附，則可以顯著地提升術(shù)后防粘連的效果。本研究將L929鼠成纖維細胞接種于mXG溫敏水凝膠表面，研究其在水凝膠表面的黏附行為。本實驗中抗細胞黏附性能研究結(jié)果顯示：相對于再粘連組大量L929鼠成纖維細胞貼壁梭形生長，伴偽足的形成，mXG溫敏水凝膠表面僅有非常少的細胞，呈圓球狀，表明mXG溫敏水凝膠具有很好的抗成纖維細胞黏附性能。鑒于mXG溫敏水凝膠有較高的凝膠強度，在有效發(fā)揮物理隔離作用的同時，還能夠明顯阻抗成纖維細胞的黏附，本文作者預(yù)測mXG溫敏水凝膠能更好地預(yù)防粘連松解術(shù)后再次粘連的發(fā)生。

本實驗中大體觀察和粘連程度評分結(jié)果顯示：再粘連組均發(fā)生了嚴重的粘連，粘連評分均在4～5分，組織病理學(xué)觀察可見粘連部分有大量膠原纖維存在，且有新生血管出現(xiàn)，這表明粘連松解術(shù)后再次粘連實驗動物模型構(gòu)建成功。商業(yè)膜組大鼠均發(fā)生粘連，粘連情況接近再粘連組，但粘連評分結(jié)果略低于再粘連組，組織病理學(xué)觀察可見粘連區(qū)域厚度并未隨著時間的延長而增厚，但粘連部分區(qū)域有新生血管生成，可見商業(yè)膜對粘連松解術(shù)后再次粘連的預(yù)防效果甚微。mXG溫敏水凝膠組中僅有2只大鼠發(fā)生輕微粘連，粘連評分在0～1分，其余均未發(fā)生粘連，隨著時間的延長損傷部位炎性細胞逐漸減少，凝膠逐漸降解，組織逐漸愈合變薄。mXG溫敏水凝膠具有優(yōu)異的溫敏性，在注射至腹壁和盲腸的創(chuàng)面后能夠快速地原位形成具有較高強度的凝膠，起到很好的物理覆蓋作用，并且mXG溫敏水凝膠降解過程中也能夠在原位維持較好的完整性。mXG溫敏水凝膠在大鼠腹壁-盲腸粘連松解術(shù)后二次損傷粘連模型中能夠有效地預(yù)防粘連的發(fā)生。

術(shù)后粘連形成的過程非常復(fù)雜,其中涉及各種生長因子和細胞因子的參與，根據(jù)其功能可分為抗粘連細胞因子和促粘連細胞因子兩類，大量文獻[14-15]表明TGF-β1和CTGF在腹腔粘連的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。

目前公認TGF-β在腹膜粘連形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，以TGF-β1作用最強[16]，TGF-β1通過自分泌和旁分泌機制激活成纖維細胞產(chǎn)生膠原，阻斷纖維蛋白溶解酶原激活物，增加血管形成和趨化成纖維細胞、單核細胞及巨噬細胞，破壞纖維蛋白溶解與合成平衡，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)沉積而有助于粘連的形成，阻斷其作用已證實可達到預(yù)防腹膜粘連形成的效果[17]。

CTGF是一種富含半胱氨酸的分泌性多肽，可由成纖維細胞、平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞合成分泌。近年研究[18-19]顯示：CTGF是介導(dǎo)TGF-β1促纖維化作用的一個重要的下游因子。Thaler等[18]發(fā)現(xiàn)：模型大鼠術(shù)后腹腔粘連組織中 CTGF水平高于正常對照組，其高峰出現(xiàn)在術(shù)后第6～15天，CTGF水平隨著粘連組織中膠原的表達而變化，故認為CTGF與腹膜粘連形成有重要的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示：對照組術(shù)后第7和14天均可見TGF-β1和CTGF高表達，商業(yè)膜組早期起到一定的物理隔離作用，防粘連膜雖然在使用前為固態(tài)膜，但是植入體內(nèi)后在創(chuàng)面滲血和腹腔液的作用下會很快變?yōu)轲こ淼娜芤籂顟B(tài)，難以長時間地存留于創(chuàng)面，因而不能在粘連形成的關(guān)鍵時期起到有效的物理阻隔作用，所以在纖維蛋白原滲出的基礎(chǔ)上，有不同程度的CTGF表達。mXG溫敏水凝膠可以完全覆蓋在傷口表面，并且有較高的凝膠強度，一方面在術(shù)后早期起到隔離作用，阻止纖維蛋白原的滲出；另一方面mXG溫敏水凝膠有很好的生物相容性和可降解性，不會對機體產(chǎn)生不良影響，所以在術(shù)后第7和14天TGF-β1和CTGF只有弱陽性表達，這與HE和Van Gieson染色結(jié)果一致，表明mXG溫敏水凝膠可以有效預(yù)防粘連松解術(shù)后再次粘連的發(fā)生。

本實驗結(jié)果顯示：采用大鼠構(gòu)建粘連松解術(shù)后再次粘連動物模型成功率高。本實驗成功復(fù)制了臨床上比較復(fù)雜的粘連松解術(shù)后再次粘連病癥模型，并且證實mXG溫敏水凝膠具有很好的預(yù)防粘連松解術(shù)后再次粘連的效果，為今后研究腹腔術(shù)后粘連奠定了良好的實驗基礎(chǔ)，也為解決粘連松解術(shù)后再粘連這一臨床難題提供了新的治療方法。

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