鎂合金浸提液對(duì)腸上皮細(xì)胞Bcl-2及Caspase-3的影響

王戰(zhàn)會(huì)，孫高斌，孫宗斌，張兵兵，鄭秋霞，劉少朋

金屬材料如不銹鋼和鎳鈦合金常被用作外科吻合釘和外科縫合材料。然而，這些金屬在人體內(nèi)會(huì)釋放一些有毒元素，比如鎳離子對(duì)周?chē)M織有致癌作用[1]。因此，尋找不含有毒元素的金屬或合金就顯得非常必要?？山到怄V合金在胃腸吻合中用作外科吻合釘和外科縫合材料似乎比較合適[2]。Witte等[3]發(fā)現(xiàn)可降解鎂合金在體內(nèi)有很好的生物相容性，并且和宿主有溫和的炎癥反應(yīng)。然而，F(xiàn)eyerabend等[4]報(bào)道鎂合金對(duì)不同的細(xì)胞有不同的影響。因此，為了研究鎂合金是否可用作外科吻合釘和外科縫合材料，了解鎂合金對(duì)腸上皮細(xì)胞的影響就顯得非常重要。將不同的植入材料植入兔的脛骨，與常用的植入材料鎳鈦合金和聚乳酸相比，術(shù)后3個(gè)月和6個(gè)月，LAE442和MgCa0.8沒(méi)有導(dǎo)致輸出淋巴結(jié)的形態(tài)出現(xiàn)改變[5]。和細(xì)胞壞死不同，凋亡需要某些基因的表達(dá)，某些受體和信號(hào)通路的介導(dǎo)[6]。為探討不同濃度Mg-Ca合金浸提液對(duì)人結(jié)腸黏膜上皮NCM460細(xì)胞Bcl-2及Caspase-3表達(dá)的影響，報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料醫(yī)療級(jí)純度的鎂鈣合金由北京大學(xué)工學(xué)院提供，該合金主要由高純度的鎂和高純度的鈣構(gòu)成。鎂鈣合金材料被加工成直徑11.3 mm、厚2 mm的圓片狀，在SiC砂紙上磨平并拋光后，用無(wú)水乙醇超聲清洗，最后用環(huán)氧乙烷消毒后待用。根據(jù)ISO 10993 制備鎂鈣合金浸提液[7]。直徑11.3 mm、厚2 mm的鎂鈣合金圓片浸沒(méi)在含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，使每1.25 cm×1.25 cm的鎂鈣合金表面積有1 mL的高糖DMEM培養(yǎng)液。浸泡有鎂鈣合金的高糖DMEM培養(yǎng)液在37 ℃含有5%CO2的培養(yǎng)箱中放置24 h，然后收集浸提液，并離心浸提液。浸提液用高糖DMEM培養(yǎng)液稀釋成100%、50%和10%的鎂鈣合金浸提液。將其保存在4 ℃冰箱中，3 d內(nèi)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2mRNA的提取NCM460細(xì)胞在不同濃度的鎂鈣合金浸提液中分別培養(yǎng)1、3、5 d。用TRIzol試劑從NCM460細(xì)胞中提取總RNA。勻漿：在培養(yǎng)瓶中加入1 mL TRIzol試劑裂解細(xì)胞，勻漿后樣品30 ℃孵育5 min。每1 mL的TRIzol試劑勻漿樣品中加入0.2 mL氯仿。手動(dòng)劇烈振蕩管體15 s后，30 ℃孵育3 min。4 ℃下12 000 r·min-1離心15 min。取上層水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后30 ℃孵育10 min后，于4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min。移去上清液，加入75%乙醇，振蕩后，4 ℃ 7 500 r·min-1離心5 min。分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，A260/280比值位于1.8～2.0之間。提取的總RNA用雙蒸水洗滌并儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中備用。

1.3逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)利用Prime-Script?RT試劑盒行反轉(zhuǎn)錄。在PTC-200 Peltier Thermal Cycler PCR反應(yīng)儀上行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，400 ng總RNA，2 μL 5× PrimeScriptTM緩沖液，0.5 μL PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I，0.5 μL Oligod T Primer(50 M)，0.5 μL Random 6 mers primer (100 μM)和RNase-free 雙蒸水共計(jì)10 μL，37 ℃孵育15 min，然后在85 ℃持續(xù)5 s反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)即停止。將得到的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液儲(chǔ)存在-20 ℃?zhèn)溆?。引物由大連Takara生物有限公司設(shè)計(jì)與合成。在LightCycler儀器上利用SYBR?Premix Ex Taq TM試劑盒進(jìn)行real-time定量PCR試驗(yàn)。PCR反應(yīng)液由如下組分配置而成：10 μL 2×SYBR?Premix Ex Taq TM buffer，0.5 μL的10 M引物，2 μL cDNA 和7.2 μL滅菌蒸餾水共計(jì)20 μL。PCR擴(kuò)增程序如下：第一個(gè)循環(huán)在95 ℃持續(xù)30 s進(jìn)行預(yù)變性，接著40個(gè)PCR循環(huán)：95 ℃持續(xù)5 s，62 ℃持續(xù)20 s。隨后在95 ℃和65 ℃之間進(jìn)行融解曲線分析，目的基因的引物序列見(jiàn)表1。

表1　Real-time RT-PCR目的基因的引物序列

1.4Westernblot實(shí)驗(yàn)在六孔板上種植NCM460細(xì)胞培養(yǎng)到細(xì)胞基本融合。然后，NCM460細(xì)胞在不同濃度的鎂鈣合金浸提液中分別培養(yǎng)1、3或5 d。接著用冷PBS洗兩次。融解Western細(xì)胞裂解液[20 mM Tris pH7.5，150 mM NaCl，1% Triton X-100，2.5 mM sodium pyrophosphate，1 mM EDTA，1%Na3VO4，0.5 μg· mL-1leupeptin，1 mM 苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)]，混勻在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mM。按照六孔板每孔加入100 μL裂解液的比例加入裂解液。充分裂解后，14 000 r·min-1離心5 min，取上清液備用。蛋白定量：以50份BCA試劑A加1份BCA試劑B(50∶1，試劑A：試劑B)的比例混合以配置BCA工作液(WR)。分別吸25 μL 標(biāo)準(zhǔn)品到微孔板的對(duì)應(yīng)孔中(濃度為0～1 000 μg· mL-1)。分別吸取2.5 μL待測(cè)樣品至微孔板對(duì)應(yīng)孔中，并加入22.5 μL稀釋液。每孔加入200 μL的WR，震板30 s以徹底混合均勻。蓋好微孔板，37 ℃孵育30 min，冷卻至室溫。測(cè)量570 nm的各孔吸收值，測(cè)得的每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔的吸收值分別減去空白孔平均光吸收值。以校正過(guò)的BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白562 nm 測(cè)量值對(duì)其濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量待測(cè)樣品蛋白濃度。按照每4 μL蛋白樣品加入1 μL蛋白上樣緩沖液(5×)的比例，混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液。沸水浴5 min，以充分蛋白變性。冷卻到室溫后，SDS-PAGE加樣孔內(nèi)上樣電泳，然后轉(zhuǎn)移到0.45 μm厚的PVDF膜。在室溫用封閉液封閉1 h，在4 ℃用一抗[兔抗-Bcl-2，1 μL 300(Santa Cruz，美國(guó))；兔抗-Caspase-3，1 μL 200(Santa Cruz，美國(guó))；兔抗-GAPDH，1∶300 (Boster，武漢，中國(guó))]孵育過(guò)夜，再用TBST沖洗3次，每次10 min，然后再用二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG)室溫孵育PVDF膜1 h。再行化學(xué)發(fā)光，顯影，定影，最后將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。

2　結(jié)果

2.1Bcl-2和Caspase-3基因表達(dá)NCM460細(xì)胞分別在100%、50%、10%浸提液和對(duì)照組處理1、3和5 d后用real-time PCR 檢測(cè)Bcl-2 and Caspase-3基因的表達(dá)。在不同濃度的浸提液處理NCM460細(xì)胞后，MMP9基因在細(xì)胞中的表達(dá)變化。在NCM460細(xì)胞分別經(jīng)100%、50%、10%浸提液處理1 d后，Bcl-2基因在10%或50%浸提液處理的細(xì)胞中的表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。處理3 d后，Bcl-2基因在50%或100%浸提液處理過(guò)的細(xì)胞中的表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。處理5 d后，Bcl-2基因在50%或100%浸提液處理過(guò)的細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于對(duì)照組 (P<0.05)，見(jiàn)圖1。NCM460細(xì)胞分別在100%、50%、10%浸提液和對(duì)照組處理1 d后，Caspase-3基因在細(xì)胞中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。處理3 d后，Caspase-3基因在50%浸提液處理過(guò)的細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。而且，在處理5 d后，Caspase-3基因在100%、50%和10%浸提液處理過(guò)的細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組的表達(dá) (P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖1　不同濃度Mg-Ca合金浸提液中NCM460細(xì)胞Bcl-2基因表達(dá)

圖2　不同濃度Mg-Ca合金浸提液中NCM460細(xì)胞Caspase-3基因表達(dá)

2.2Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)NCM460細(xì)胞在不同濃度浸提液處理1、3和5 d后用Western blotting 檢測(cè)Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達(dá)。處理5 d后，Bcl-2基因在50%或100%浸提液處理細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于對(duì)照組的表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)圖3。而處理5 d后，Caspase-3在100%、50%和10%浸提液細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組的表達(dá) (P<0.05)，見(jiàn)圖4。

A：Western blotting檢測(cè);B：Bcl-2/GAPDH蛋白比值。1:對(duì)照；2：10%浸提液；3：50%浸提液；4：100%浸提液。圖3　不同濃度Mg-Ca合金浸提液中培養(yǎng)5 d NCM460細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)

A：Western blotting檢測(cè)；B：Caspase-3 /GAPDH蛋白比值。1:對(duì)照；2：10%浸提液；3：50%浸提液；4：100%浸提液。圖4　不同濃度Mg-Ca合金浸提液中培養(yǎng)5 d NCM460細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)

3　討論

Bcl-2是細(xì)胞凋亡的細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)[8]。Bcl-2的功能不是促進(jìn)細(xì)胞增殖而是抑制細(xì)胞程序性死亡[9]。而Caspases是由能促進(jìn)凋亡的至少14個(gè)成員構(gòu)成的大家族[10]。Caspase-3是大家族的成員之一，處于凋亡有序“瀑布式”級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是最重要也是最終的效應(yīng)執(zhí)行者。多數(shù)誘導(dǎo)凋亡因素依靠Caspase蛋白的級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡，Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的最關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，Caspase-3蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑是多數(shù)凋亡刺激因素導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。通過(guò)評(píng)價(jià)Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)，以更深入地了解可降解鎂合金對(duì)腸上皮細(xì)胞的影響。NCM460細(xì)胞系被廣泛應(yīng)用于體外實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)腸道植入材料的生物相容性。

3.1鎂合金的降解產(chǎn)物對(duì)NCM460細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的Mg-6Zn合金浸提液即可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，Bcl-2基因的表達(dá)也降低[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在NCM460細(xì)胞經(jīng)100%、50%、10%浸提液和對(duì)照組處理5 d后，Bcl-2基因在50%或100%浸提液處理細(xì)胞的表達(dá)顯著低于對(duì)照組，與上述文獻(xiàn)結(jié)果相一致。導(dǎo)致Bcl-2在不同濃度浸提液處理的細(xì)胞中表達(dá)不一致的機(jī)制仍不清楚，可能與浸提液中的鈣離子濃度有關(guān)。胞內(nèi)Ca2+濃度超載可以導(dǎo)致線粒體損傷，釋放細(xì)胞色素C，活化Caspases，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。Caspase-3與其他凋亡蛋白家族成員發(fā)揮作用，通過(guò)降解凋亡抑制蛋白Bcl-2，使Caspase家族成員激活并被水解后形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最后在核小體連接處切割DNA鏈接片段，使細(xì)胞凋亡[13]。

3.2鎂合金的降解產(chǎn)物對(duì)NCM460細(xì)胞Caspase-3表達(dá)的影響有研究發(fā)現(xiàn)，Mg-6Zn合金浸提液在一定范圍內(nèi)處于較高濃度時(shí)易誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞凋亡及Caspase-3的表達(dá)，且隨濃度升高影響增大[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在NCM460細(xì)胞經(jīng)100%、50%、10%浸提液和對(duì)照組處理5 d后，Caspase-3基因在100%、50%和10%浸提液處理細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組的表達(dá)，與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果相一致[15]。同樣，導(dǎo)致Caspase-3在不同濃度浸提液處理的細(xì)胞中的表達(dá)不一致的機(jī)制仍不清楚，可能與浸提液中的鎂離子及鈣離子濃度有關(guān)[16]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，一些稀有元素對(duì)細(xì)胞凋亡也有影響[17-18]。同時(shí)，也有研究報(bào)道氟化物修飾的鎂合金對(duì)細(xì)胞凋亡沒(méi)有明顯影響[19]。許多研究認(rèn)為，植入的鎂合金對(duì)植入物附近的細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響，這可能與植入物降解較慢，同時(shí)降解的離子會(huì)擴(kuò)散到血液及遠(yuǎn)處組織有關(guān)[11]。

總之，Mg-Ca合金浸提液在一定范圍內(nèi)處于較高濃度時(shí)易誘導(dǎo)NCM460細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)，而抑制Bcl-2的表達(dá)，可能與鎂離子及鈣離子濃度有關(guān)。通過(guò)對(duì)Bcl-2和Caspase-3聯(lián)合活性測(cè)定，可以進(jìn)一步了解Mg-Ca合金浸提液對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，對(duì)進(jìn)一步研究Mg-Ca合金的生物相容性提供有利幫助。

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