高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中7種B族維生素含量

武中平，王 莉，高 巍，曹 磊，朱利利，汪洪濤，孫 牧，王薇薇

(江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇南京 210007)

維生素是維持人體健康所必需的一類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。目前已知的維生素有數(shù)十種，絕大多數(shù)不能在體內(nèi)合成，或者所合成的量難以滿足機(jī)體的需要，必須通過(guò)日常飲食進(jìn)行補(bǔ)充。維生素按溶解性可分為兩大類(lèi)，即水溶性維生素和脂溶性維生素[2]。水溶性維生素主要包括維生素C和B族維生素，它們易溶于水。B族維生素也叫乙族維生素、維他命B、維生素B雜或維生素B復(fù)合群，常見(jiàn)的有硫胺素(B1)、核黃素(B2)、煙酸、煙酰胺(B3)、泛酸(B5)、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺(B6)、生物素(B7)、葉酸(B9)、鈷胺素(B12)等[3]。這些維生素全是輔酶，有共同的特性：是把糖、脂肪、蛋白質(zhì)等轉(zhuǎn)化成熱量時(shí)不可缺少的物質(zhì)，可以幫助維持心臟、神經(jīng)系統(tǒng)功能，維持消化系統(tǒng)及皮膚的健康，但它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上沒(méi)有同一性。如果缺少B族維生素，則細(xì)胞功能馬上降低，引起代謝障礙，人體易出現(xiàn)怠滯和食欲不振。在嬰幼兒配方奶粉中常添加一定量的B族維生素，以保證嬰幼兒攝取的需要[4]。但添加量必須控制在一定范圍，以免產(chǎn)生不良影響。因此檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中的B族維生素含量有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，有一系列食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)可用于對(duì)食品(包含嬰幼兒配方奶粉)中B族維生素的檢測(cè)[5-12]。在這些標(biāo)準(zhǔn)中，主要有3種檢測(cè)方法：①微生物法，如維生素B3(第一法)、維生素B5(第一法)、維生素B7、維生素B9、維生素B12等；②熒光分光光度法，如維生素B1(第二法)、維生素B2(第二法)等；③高效液相色譜法，包括熒光檢測(cè)器法和紫外檢測(cè)法，如維生素B1(第一法)、維生素B2(第一法)、維生素B3(第二法)、維生素B6(第一法)、維生素B5(第二法)等。微生物法靈敏度高，但操作繁鎖、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)人員要求較高、影響結(jié)果的因素多，重復(fù)性稍差[13-14]。熒光分光光度法有一定的特異性，但參與反應(yīng)的試劑一般都有毒性，對(duì)操作人員有一定的傷害，同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)室要對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，因此操作也較為繁瑣。采用高效液相色譜法測(cè)定B族維生素時(shí)，樣品前處理較為簡(jiǎn)單，有較高的靈敏度，但測(cè)定時(shí)經(jīng)常采用離子對(duì)試劑，使得色譜柱壽命大大減低，同時(shí)B族維生素結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)差別大，很難用同一操作條件完成多種B族維生素分離、測(cè)定[15]。隨著質(zhì)譜技術(shù)和柱填料技術(shù)的不斷發(fā)展，已有不少用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)食品中維生素含量的報(bào)道[16-24]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可提供可靠、精確的相對(duì)分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)信息，具有快速、靈敏度高的特點(diǎn)，能更好地滿足嬰幼兒配方奶粉等復(fù)雜樣品中有機(jī)化合物的測(cè)定。

筆者對(duì)提取溶劑的種類(lèi)及濃度、超聲時(shí)間等樣品前處理?xiàng)l件、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜操作條件、方法學(xué)指標(biāo)、樣品實(shí)際測(cè)定進(jìn)行了研究，建立了一種采用高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中7種B族維生素含量的方法。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑Agilent1290-G6460C高壓液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀；KQ-500DE超聲波清洗器； SIGMA 3-18K高速冷凍離心機(jī)；HH-S8恒溫水浴鍋；BSA224S-CW電子分析天平；Milli-Q Integral型超純水系統(tǒng)；0.45 μm水相濾膜。

標(biāo)準(zhǔn)品：硫胺素(純度≥95.3%)、核黃素(純度≥99.9%)、吡哆醇(純度≥99.6%)、吡哆醛(純度≥99.5%)、吡哆胺(純度≥99.5%)、煙酸(純度≥99.8%)、煙酰胺(純度≥99.9%)。

單標(biāo)儲(chǔ)備溶液：1.00 g/L，稱(chēng)取硫胺素、核黃素、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、煙酸、煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用0.1%甲酸溶液(體積分?jǐn)?shù)，下同)溶解并定容，于-18 ℃下避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別移取上述單標(biāo)儲(chǔ)備溶液于10 mL棕色容量瓶中，用0.1%甲酸水溶液稀釋?zhuān)渲瀑|(zhì)量濃度為0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，密封后避光于-18 ℃下保存。

甲醇為色譜純，甲酸、正己烷為分析純，水為Milli-Q Integral型超純水系統(tǒng)制備的一級(jí)水。

嬰幼兒配方奶粉購(gòu)置于某超市。

1.2儀器工作條件液相色譜條件：Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液，B為甲醇；流量0.2 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量5 μL。梯度洗脫程序：0～1.00 min時(shí)，A為99%；1.01～4.00 min時(shí)，A由99%降為45%；4.01～6.00 min時(shí)，A為45%；6.01～6.10 min時(shí)，A由45%升為99%；6.11～10.00 min時(shí)，A為99%。

質(zhì)譜條件：ESI+離子化模式；霧化氣壓力40 psi；毛細(xì)管電壓4.0 kV；脫溶劑氣(氮?dú)?流量10 L/min；脫溶劑氣溫度350 ℃；碰撞氣高純氮(99.999%)；MRM監(jiān)測(cè)模式(監(jiān)測(cè)參數(shù)見(jiàn)表1)。

表1 MRM模式下的監(jiān)測(cè)參數(shù)

1.3試驗(yàn)方法稱(chēng)取5.0 g奶粉樣品于燒杯中，加入50 mL 0.1%甲酸溶液，在45 ℃恒溫水浴鍋中攪拌2 min，取出，加入5 mL正己烷，超聲提取20 min，取35 mL樣品溶液于離心管中，在15 ℃下以10 000 r/min離心10 min，用一次性塑料滴管小心取出5 mL中層澄清液，用0.45 μm水相濾膜過(guò)濾，棄去前面2 mL濾液，收集2 mL濾液于樣品瓶中，待測(cè)。在避光條件下進(jìn)行試驗(yàn)，待測(cè)樣品在最短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)試。

2 結(jié)果與分析

2.1流動(dòng)相體系的選擇用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中水溶性維生素含量時(shí)，一般采用二元流動(dòng)相體系：A為0.1%甲酸溶液或10 mmol/L醋酸銨溶液，B為甲醇或乙腈。筆者對(duì)4種流動(dòng)相體系：0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、10 mmol/L醋酸銨-甲醇、10 mmol/L醋酸銨-乙腈進(jìn)行了試驗(yàn)，重點(diǎn)考察7種待測(cè)B族維生素在不同流動(dòng)相體系下的響應(yīng)值。表2為7種待測(cè)B族維生素(濃度10 mg/L)在4種流動(dòng)相體系下的響應(yīng)值(用MS2 SIM模式下母離子峰高表示)。從表2可以看出，核黃素、吡哆醇、吡哆醛、煙酸、煙酰胺在0.1%甲酸-甲醇流動(dòng)相體系下響應(yīng)值最大，硫胺素、吡哆胺在10 mmol/L醋酸銨-甲醇流動(dòng)相體系下響應(yīng)值最大。為了使多數(shù)待測(cè)物有最大響應(yīng)值，筆者選擇0.1%甲酸-甲醇作為測(cè)定時(shí)的流動(dòng)相體系。

表2 不同流動(dòng)相體系下的7種維生素的響應(yīng)值

2.2提取溶液及濃度的選擇嬰幼兒配方奶粉含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪，還會(huì)添加較多種類(lèi)的營(yíng)養(yǎng)成分，使得測(cè)定其中維生素含量比較困難：一是要找到合適的提取溶液，能最大限度地將待測(cè)維生素提取出來(lái)；二是要采用合適的方式減少提取液中的蛋白質(zhì)、脂肪含量，以減輕樣品測(cè)定時(shí)對(duì)儀器的損害。筆者對(duì)3種提取溶液：0.1 mol/L鹽酸、10 mmol/L醋酸銨、0.1%甲酸進(jìn)行了試驗(yàn)，重點(diǎn)考察5.0 g樣品按照“1.3”試驗(yàn)方法處理后濾液的澄清度及7種待測(cè)B族維生素含量。試驗(yàn)表明，用0.1 mol/L鹽酸、10 mmol/L醋酸銨作為提取溶液時(shí)，樣品溶液在離心后依然較為渾濁。而用0.1%甲酸作為提取溶液時(shí)，離心后能得到澄清液體。用不同提取溶液提取后，樣品中待測(cè)維生素的響應(yīng)值也不一樣。表3為不同提取溶液提取后樣品中待測(cè)維生素的響應(yīng)值(用MS2 SIM模式下母離子峰面積表示)。研究還考察了不同濃度(0.1%、1%、10%)甲酸溶液提取效果及待測(cè)維生素的響應(yīng)值。試驗(yàn)表明，隨著甲酸濃度的增加，經(jīng)離心后得到提取液的澄清度反而下降。用不同濃度甲酸溶液提取后，樣品中待測(cè)維生素的響應(yīng)值也不同。表4為不同濃度甲酸溶液提取后樣品中待測(cè)維生素的響應(yīng)值(用MRM模式下定量子離子峰面積表示)。綜合考慮后，選擇0.1%甲酸作為嬰幼兒配方奶粉中7種B族維生素測(cè)定時(shí)樣品提取溶液。

表3 3種提取液提取后樣品中待測(cè)維生素的響應(yīng)值

表4 不同濃度甲酸溶液提取后樣品中待測(cè)維生素的響應(yīng)值

2.3超聲時(shí)間的選擇將超聲波應(yīng)用于化學(xué)分析時(shí)，應(yīng)結(jié)合樣品類(lèi)型、待測(cè)物性質(zhì)對(duì)超聲提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化[25]，以確保多數(shù)待測(cè)物有較高的提取效率。筆者在確定好提取溶劑、濃度后，對(duì)相同樣品在不同超聲提取時(shí)間(10、15、20、25 min)待測(cè)維生素的提取效率進(jìn)行了比較。相同樣品不同超聲提取時(shí)間待測(cè)維生素的響應(yīng)值(用MRM模式下定量子離子峰面積表示)見(jiàn)表5。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，樣品中5種待測(cè)維生素(吡哆胺為未檢出)超聲提取20 min時(shí)響應(yīng)值達(dá)到最大，而在超聲提取25 min后，響應(yīng)值略有下降，可能是超聲波對(duì)待測(cè)維生素有一定的破壞作用，隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)，這種作用的效果會(huì)更明顯。

表5 不同提取時(shí)間樣品中待測(cè)維生素的響應(yīng)值

2.4方法學(xué)指標(biāo)驗(yàn)證

2.4.1方法的線性范圍與檢出限。吸取一定體積的7種維生素的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用0.1%甲酸溶液稀釋定容，配制成0.1 mg/L(吡哆胺、煙酰胺)、1、5、10、20、50 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在“1.2”條件下測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。7種待測(cè)維生素在線性范圍內(nèi)具有良好相關(guān)性。以3倍信噪比計(jì)算方法最低檢出限。線性范圍及最低檢出限的結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 7種維生素的線性范圍和檢出限

2.4.2加標(biāo)回收率及精密度。在5.0 g樣品中分別添加低、中、高3個(gè)濃度水平(每個(gè)濃度進(jìn)行6次平行試驗(yàn))的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后，按“1.3”進(jìn)行處理，在“1.2”條件下測(cè)定，得到其中待測(cè)維生素的峰面積，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。樣品加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表7。7種B族維生素加標(biāo)回收率為75.25%～107.65%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3%以下，符合嬰幼兒配方奶粉中B族維生素含量測(cè)定的要求。

表7樣品加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

Table7Theaddingstandardmatteramountandstandarddeviationofthesample

名稱(chēng)Name樣品實(shí)測(cè)含量Themeasuredcontentofthesample∥mg/L加標(biāo)量Theaddingstandardmatteramount∥mg平均加標(biāo)回收率Averagestandardrecoveryrate∥%RSD%核黃素2.260.10103.302.13Riboflavin0.2098.951.051.0088.931.14硫胺素0.060.0175.252.98Thiamine0.0278.452.450.1080.991.56吡哆醇0.460.01107.651.71Pyridoxine0.02104.180.260.1088.891.87吡哆胺未檢出0.1083.252.36Pyridoxamine0.2082.941.751.0082.511.63吡哆醛0.130.01105.500.86Pyridoxal0.02100.020.550.1081.360.98煙酸0.040.0189.201.49Niacin0.0285.831.620.1081.421.51煙酰胺3.290.1080.402.93Nicotinamide0.2089.471.121.0086.820.87

2.5實(shí)際樣品測(cè)定稱(chēng)取6份相同質(zhì)量的樣品，按“1.3”進(jìn)行處理，在“1.2”條件下測(cè)定，得到其中待測(cè)維生素的峰面積，計(jì)算峰面積平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表8。數(shù)據(jù)表明，奶粉中B族維生素含量實(shí)際測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在5%以下，說(shuō)明該方法能很好測(cè)定嬰幼兒奶粉中B族維生素含量。

表8 樣品中維生素含量的平行測(cè)定(n=6)

3 結(jié)論

該研究建立了一種高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中7種B族維生素(核黃素、硫胺素、吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛、煙酸、煙酰胺)含量的方法，該方法具有操作步驟簡(jiǎn)單、靈敏度高、分離度好、檢測(cè)效率高等優(yōu)點(diǎn)，可用于嬰幼兒配方奶粉中B族維生素含量的檢測(cè)。

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