卵子激活提高凍融睪丸精子ICSI效率

巢時斌 吳成亮 張杰 蘇占營 辜敏

[摘要] 目的 研究卵子激活能否改善凍融睪丸精子行卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）時的受精率和胚胎發(fā)育。 方法 選擇2015年1月～2017年6月我院收治的42例行凍融睪丸精子ICSI助孕治療的患者作為研究對象，按照患者ICSI后是否進行人工卵子激活（AOA）隨機分為（普通凍融睪丸精子）對照組（n=23）和卵子激活組（n=19），對兩組受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)，可利用胚胎數(shù)和臨床妊娠率進行比較。 結(jié)果 與對照組相比，卵子激活組有更高的受精率（53.21% vs 71.65%，P<0.05），更多的平均優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)（1.96 vs 4.13，P<0.05），更多的平均可利用胚胎（2.58 vs 5.58，P<0.05），更高的臨床妊娠率但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（56.25% vs 66.67%，P>0.05）。 結(jié)論 卵子激活提高凍融睪丸精子行ICSI效率。

[關(guān)鍵詞] 卵子激活；卵胞漿內(nèi)單精子注射；體外受精與胚胎移植；受精機制；凍融睪丸精子

[中圖分類號] R714；R698 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）06-0028-03

[Abstract] Objective To investigate whether the activation of ovums can improve the fertilization rate and embryo development in intracytoplasmic sperm injection（ICSI） of frozen-thawed testis sperm. Methods Forty-two patients undergoing ICSI assisted pregnancy with frozen-thawed testis in Jiujiang Maternal and Child Health Care Hospital from January 2015 to June 2017 were enrolled in this study. Patients were randomly divided into（normal frozen-thawed testis sperm） control group（n=23） and oocyte activation ovum-activated group（n=19） according to whether artificial ovum activation（AOA） was carried out， the number of fertile embryos and the number of high-quality embryos， the number of available embryos and the clinical pregnancy rate of the two groups were compared. Results Compared with the control group， the ovum-activated group had higher fertilization rate（53.21% vs 71.65%， P<0.05）， more average high-quality embryos（1.96 vs 4.13， P<0.05）， more average available embryos（2.58 vs 5.58， P<0.05）. The higher clinical pregnancy rate was not statistically significant（56.25% vs 66.67%， P>0.05）. Conclusion Ovum activation enhances the ICSI efficiency of frozen-thawed testicular sperm.

[Key words] Ovum activation；Intracytoplasmic sperm injection；In vitro fertilization and embryo transplantation；Mechanism of fertilization；Freeze-thaw testicular sperm

卵胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperminjection，ICSI）技術(shù)的應(yīng)用是輔助生殖技術(shù)的又一個里程碑[1]。ICSI是把單個精子通過顯微操作注射到卵子內(nèi)完成受精，是目前治療男性嚴重少弱精子癥的最有效的輔助生殖技術(shù)，對無精子癥患者采用顯微外科睪丸精子抽取術(shù)（testicularspiration，TESA）獲得的極少量的精子也可以取得滿意的臨床結(jié)局，已經(jīng)成為試管嬰兒的常規(guī)技術(shù)之一。睪丸精子抽取術(shù)是有創(chuàng)手術(shù)，給無精子癥患者生理和心理創(chuàng)傷，且睪丸精子的有無和活力的好壞和穿刺部位有相關(guān)性。因此，進行診斷性睪丸抽取術(shù)時發(fā)現(xiàn)有活動精子時會及時把精子冷凍。冷凍睪丸精子復(fù)蘇后用于ICSI，可以減少反復(fù)穿刺帶來的并發(fā)癥，但由于睪丸精子本身活動力低，凍融后進一步降低睪丸精子的活動力，因此受精率、胚胎發(fā)育和臨床結(jié)局均不如新鮮睪丸精子[2]。雖然有部分研究如何從不活動的精子中篩選活精子的方法，但效果不一[3]。卵子激活技術(shù)能有效提高精子激活卵子不足導(dǎo)致的受精障礙[4，5]。本研究比較了卵子激活技術(shù)對凍融睪丸精子的受精和胚胎發(fā)育，臨床結(jié)局的影響，旨在為臨床進一步應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2014年9月～2017年9月因男方無精癥在九江市婦幼保健院輔助生殖科接受使用凍融睪丸精子行ICSI不孕癥患者為研究對象。其中，應(yīng)用卵子激活技術(shù)的凍融睪丸精子19個周期（卵子激活組），未應(yīng)用卵子激活技術(shù)的凍融睪丸精子23個周期（對照組）。

1.2 方法

1.2.1 睪丸精子的獲得和冷凍與復(fù)蘇 診斷性睪丸活檢，患者于局麻下行TESE術(shù)，繃緊陰囊皮膚，在睪丸中部，用輸精管分離尖鉗垂直陰囊皮膚穿刺，當(dāng)有明顯突破感時稍微張開鉗子，夾取少量睪丸組織并放入培養(yǎng)液中，于顯微鏡直視下將睪丸組織撕碎，并觀察有無活動精子。睪丸組織的冷凍：按體積比1∶1加入精子冷凍保護劑（美國Quinns產(chǎn)品），冷凍管內(nèi)靜置5 min，待睪丸組織與保護劑充分混勻，液氮中懸吊15 min后投入液氮冷凍保存。冷凍睪丸組織的復(fù)蘇：女方取卵當(dāng)日，從液氮中取出冷凍管迅速投入37℃水浴10 min，融解后先用1 mL注射器分開曲細精管，清洗2遍，盡量多地去除紅細胞，然后用兩只折彎角度為90°的1 mL注射器針頭將精子從曲細精管中擠出至0.5 mL培養(yǎng)液中，取出反復(fù)擠壓過的曲細精管，置于37℃、6%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 h，若有活動精子，挑選活動精子行ICSI，若無活動精子，則選擇尾部彎曲柔軟精子行ICSI。

1.2.2 促排卵、取卵、受精及胚胎移植 控制性刺激排卵方案采取短效長方案，降調(diào)超過14 d時對女方激素水平、竇狀卵泡直徑及子宮內(nèi)膜厚度進行測定，達到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后應(yīng)用促性腺激素100～250 U啟動控制下卵巢刺激周期，并對患者血清雌二醇和促黃體生成素水平及卵泡情況進行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果合理調(diào)整促卵泡激素用量。當(dāng)直徑達到18 mm的主導(dǎo)卵泡超過3個時肌內(nèi)注射5000～10 000 U人絨毛膜促性腺激素，36 h后經(jīng)B超引導(dǎo)取出卵細胞。取出卵冠丘復(fù)合物立即放入培養(yǎng)液，HCG 38～40 h后選取MⅡ卵子行ICSI。以雙原核（2PN）卵子作為正常受精卵。第3天選擇1～3個Ⅱ級胚胎進行移植。

1.2.3 卵子激活 對于卵子激活組，ICSI后，立即將卵子移入含有10 μM鈣離子載體A23187（Sigma），20 min后用培養(yǎng)液充分洗滌后轉(zhuǎn)移到37°C 和 6% CO2培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 觀察指標(biāo)

兩組的卵子數(shù)，MⅡ（成熟卵）率、受精率、正常受精率（2PN）、平均可利用胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)等被納入觀察指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以[n（%）]或（n/n）表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的一般資料比較

卵子激活組與對照組兩組患者的女方年齡、不孕年限、BMI指數(shù)、基礎(chǔ)FSH、LH、竇卵泡數(shù)等均無顯著性差異（P>0.05），具有可比性。見表1。

2.2兩組受精和胚胎發(fā)育情況

兩組治療受精、正常受精（2PN）、胚胎發(fā)育、妊娠結(jié)局：兩組的MⅡ（成熟卵）率無顯著性差異；受精率、正常受精率（2PN）、平均可利用胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)具有顯著性差異（P<0.05），臨床妊娠率卵子激活組略高，但無顯著性差異（P>0.05）。見表2。

3 討論

ICSI是將單個精子直接注入卵子胞質(zhì)內(nèi)激活卵子完成受精和胚胎發(fā)育，對男性不育患者，如梗阻性無精癥、重度少弱畸精子癥等，和常規(guī)的體外受精胚胎移植可以達到相同的臨床結(jié)局[6]。ICSI不僅能使用射出精子，還能采用附睪、睪丸中的精子并且均能使卵子完成受精和胚胎發(fā)育，取得和常規(guī)體外受精胚胎移植一樣的臨床結(jié)局[7]。由于睪丸活檢手術(shù)對男性的生理和心理均造成一定創(chuàng)傷，并且由于對曲細精管穿刺部位的差異，很可能導(dǎo)致取卵當(dāng)日穿刺取精的失敗[8]。因此，在行診斷性睪丸活檢時發(fā)現(xiàn)有活動精子時進行微量的睪丸精子冷凍，之后在取卵當(dāng)日使用凍融睪丸精子行ICSI。和射出精液中的精子相比，睪丸精子成熟度和活動能力有一定程度的下降。睪丸精子經(jīng)過冷凍復(fù)蘇，活動能力和受精能力進一步的下降，推測是由于精子激活卵子的能力下降引起。

卵子的受精機制迄今尚未完全闡明，受精是精子和卵子之間相互作用的多步驟、多分子參與的復(fù)雜過程。一般認為，其至少包括精子獲能、頂體反應(yīng)、精子穿過卵子透明帶、精子和卵子質(zhì)膜融合、卵子皮質(zhì)反應(yīng)、卵子激活、雌雄原核形成等過程。精子進入到卵子后，釋放精子起源的可溶性卵子激活因子（SOAF）誘發(fā)卵子細胞內(nèi)鈣離子有規(guī)律的波動稱為鈣震蕩，鈣離子濃度的改變導(dǎo)致相關(guān)的離子通道開放，從而激活卵子[9，10]。最近許多證據(jù)表面，位于精子頭部的PLC§可能是這種卵子激活因子[11]。ICSI受精方式繞過了精子獲能、頂體反應(yīng)、穿過透明帶等步驟，直接把制動后精子注入卵子胞漿內(nèi)。制動精子時通過注射針的機械應(yīng)力劃破精子尾部質(zhì)膜，有利于釋放精子中的卵子激活因子，因此與常規(guī)的體外受精方式受精失敗達到10%左右相比，ICSI的受精方式更加有保障。盡管如此，ICSI仍有1%～2%患者面臨受精失敗的風(fēng)險[12]。研究顯示，ICSI受精失敗多是由于精子缺乏卵子激活因子引起[13，14]。因此，采用人工卵子激活的方法模擬自然狀態(tài)下精子釋放卵子激活因子引發(fā)鈣離子震蕩可以挽救ICSI受精失敗[5]，人工激活的方法包括物理和化學(xué)方法，如使用離子霉素、鈣離子載體A23187[15，16]。為改善凍融精子行ICSI受精率和胚胎發(fā)育，本研究中采用鈣離子載體A23187進行卵子激活。卵子激活后明顯提高了卵子的2PN受精率，更多的優(yōu)質(zhì)胚胎和可利用胚胎（P<0.05）（表2）。盡管單次的移植成功率沒有顯著差異，但顯然提高了實驗組的累計妊娠率。

盡管卵子激活的適應(yīng)癥隨著臨床的成功運用越來越廣泛，已經(jīng)成功的運用于前次ICSI完全受精失敗和受精率低下的患者，取得了很好的臨床效果，目前出生的嬰兒越來越多，子代安全性研究也未發(fā)現(xiàn)和自然受孕出生嬰兒有差異。但是仍需要更進一步的觀察和多中心大樣本的研究。

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（收稿日期：2017-11-12）