P16和Ki-67在宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變中的表達(dá)*

丁莉利,牛海艷,楊 丞，鄭 晶

(海南醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室,?？?571199)

《WHO女性生殖器官腫瘤學(xué)分類(第4版)》對宮頸鱗狀細(xì)胞癌前病變采用二級分類法，即分為低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LISL)和高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HISL)[1]。該分類法更能反映病變的生物學(xué)行為，且與臨床治療方案相關(guān)，因此臨床要求在宮頸組織學(xué)活檢診斷中應(yīng)明確區(qū)分LSIL與HSIL。新分類的HSIL包括宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)2和CIN3病變，但以往根據(jù)形態(tài)診斷的CIN2可能部分為LSIL、部分為HSIL，籠統(tǒng)將CIN2都?xì)w入HSIL，可能導(dǎo)致HSIL的擴(kuò)大化。研究提示P16和Ki-67是有助于區(qū)分宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的免疫標(biāo)志物,但不同文獻(xiàn)采用不同的判讀標(biāo)準(zhǔn)[2-6]。本研究將探討P16和Ki-67在宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變中的表達(dá)水平和表達(dá)方式，分析它們在宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變中的診斷意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2015年1月至2015年12月的宮頸組織石蠟包埋標(biāo)本，選取診斷明確的LSIL、HSIL標(biāo)本各 40例。所有宮頸組織均為宮頸活檢和LEEP刀標(biāo)本。

1.2方法 所有標(biāo)本經(jīng)4%中性緩沖甲醛液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 mm厚切片，HE染色，光鏡觀察。免疫組織化學(xué)染色采用EnVision法，抗原修復(fù)采用高壓高溫煮沸法，所用單克隆抗體P16、Ki-67和顯色試劑盒均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，操作步驟按說明書進(jìn)行。

1.3結(jié)果判定 P16染色定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，Ki-67染色定位于細(xì)胞核。P16染色結(jié)果判讀依陽性細(xì)胞在鱗狀上皮分布的垂直平面行半定量報告：P16染色以超過上皮層下1/3以上彌漫且強(qiáng)的染色為1+，超過上皮層下2/3以上彌漫且強(qiáng)的染色為2+。Ki-67染色結(jié)果判讀依陽性細(xì)胞數(shù)行半定量報告：陽性細(xì)胞數(shù)占11%～30%為1+，31%～50%為2+,>50%為3+。Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)小于或等于10%或僅基底及基底旁細(xì)胞著色均判為陰性。所有病例均經(jīng)2位高年資病理醫(yī)生在多投顯微鏡下討論，并確定診斷。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，等級資料采用秩和檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1P16在不同宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變中的表達(dá)情況 P16在LISL組、HSIL組中陽性表達(dá)率分別為17.5%(7/40)、100%(40/40)，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=56.17，P<0.01),P16在HSIL組中的陽性表達(dá)率顯著高于LSIL組，見表1。P16在LISL組中雖有7例染色陽性，但強(qiáng)染色均未超過上皮層下2/3。另有18例LISL病例P16出現(xiàn)斑駁或弱的染色,均判為陰性(圖1)。P16在HSIL組中染色均超過上皮層下l/3,且34例呈超過上皮層2/3或全層表達(dá)，呈連續(xù)、彌漫強(qiáng)表達(dá)(圖2)。

2.2Ki-67在不同宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變中的表達(dá)情況 Ki-67在LISL組、HSIL組中總陽性表達(dá)率分別為87.5%(35/40)、100%(40/40)，在兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.41，P>0.05)，見表1。但Ki-67染色細(xì)胞數(shù)在兩組之間有顯著性差異(Z=7.60，P<0．01)，Ki-67在HSIL組中染色陽性細(xì)胞數(shù)比LSIL組多。LISL組Ki-67陽性病例的染色細(xì)胞不僅數(shù)量上以1+為主，而且染色細(xì)胞主要位于上皮層的下1/3，中上層僅個別細(xì)胞表達(dá)(圖3)。HSIL組病例的Ki-67染色細(xì)胞數(shù)量上以2+及以上為主，且上皮層1/3以上、甚至全層有大量染色細(xì)胞分布(圖4)。

表1 P16和Ki-67在宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變中的表達(dá)(n)

表2 Ki-67在 P16 1+表達(dá)的宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變中的表達(dá)(n)

2.3Ki-67在 P16 1+表達(dá)的宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變中的表達(dá)情況 P16在LSIL組、HSIL組分別有7例和6例為1+表達(dá)，占全部病例數(shù)的16.25%(13/80)。若P16 1+表達(dá)的病例以Ki-67 1+表達(dá)為標(biāo)準(zhǔn)判為LSIL,以Ki-67 2+及以上表達(dá)為標(biāo)準(zhǔn)判為HSIL，則分別有4例LSIL和4例HSIL的組織學(xué)類型與免疫表型相符合，僅5例P16 1+表達(dá)的病例免疫表型與組織學(xué)類型不符，占全部病例數(shù)的6.25%(5/80)。見表2。

圖1 LISL中P16呈弱的染色(×400)

圖2 HISL中P16呈彌漫、強(qiáng)染色(×400)

圖3 LISL中Ki-67呈1+表達(dá)(×400)

3 討 論

宮頸鱗癌的癌前病變與高危人類乳頭瘤病毒(HPV)感染關(guān)系密切?；颊咴诟腥靖呶PV后，HPV的DNA在機(jī)體內(nèi)以2種形式存在，即游離形式和整合形式。HPV DNA在細(xì)胞內(nèi)以游離狀態(tài)存在時，組織學(xué)形態(tài)上表現(xiàn)為正?；騆SIL，絕大部分感染者將通過自身免疫機(jī)制清除病毒。大量的回顧性研究顯示，經(jīng)活檢證實(shí)的LSIL整體預(yù)后良好，大部分病例會在1年之內(nèi)消失。若持續(xù)性高危型HPV感染，病毒的DNA可發(fā)生斷裂，并與宿主細(xì)胞的基因整合，組織學(xué)形態(tài)上常表現(xiàn)為HSIL。如果不經(jīng)過恰當(dāng)?shù)闹委?，大約1/3的HSIL可以在30年間進(jìn)展為癌。因而從臨床目前規(guī)范的宮頸病變處理的流程來看，對于病理診斷為LSIL的患者僅需隨診觀察，而HSIL患者則需要根據(jù)情況進(jìn)行臨床治療[7]。因此宮頸組織學(xué)活檢診斷區(qū)分LSIL與HSIL有重要的臨床意義。CIN分為3級：CIN1、CIN2和CIN3。第4版WHO(2014)女性生殖系統(tǒng)腫瘤分類將CINl 病變歸入LSIL,將CIN2和CIN3病變歸入HSIL[1]。有文獻(xiàn)報道，不同病理醫(yī)師對于CIN2級病變的診斷一致性僅為43%[8]。因此不能簡單地將活檢診斷的CIN2都?xì)w入HSIL,需要對這樣的病變進(jìn)行進(jìn)一步的區(qū)分。

當(dāng)HPV DNA整合到宿主細(xì)胞基因組中，病毒DNA上的E6、E7癌基因表達(dá)蛋白能引起自身調(diào)節(jié)和宿主調(diào)節(jié)基因表達(dá)失調(diào)，從而影響正常細(xì)胞周期調(diào)控，導(dǎo)致宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生惡變。其中E7蛋白能結(jié)合pRb蛋白，失活的pRb可以反饋性刺激抑癌基因P16表達(dá)，研究認(rèn)為P16的強(qiáng)陽性表達(dá)即意味著HPV在細(xì)胞中的整合[9]，這提示P16可作為HSIL診斷的標(biāo)志物。本研究中P16在HSIL組中的表達(dá)陽性率明顯高于LISL組，且在HSIL中呈連續(xù)、彌漫強(qiáng)陽性表達(dá)，并以超過上皮層下2/3或達(dá)全層的表達(dá)模式為主。而P16在LISL組中不但表達(dá)陽性率低，且陽性表達(dá)病例的染色也主要位于上皮層下2/3以內(nèi)。因此在對宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變進(jìn)行診斷時，不僅應(yīng)慎重判斷P16 的陰陽性，應(yīng)還對陽性病例仔細(xì)觀察P16在上皮中的表達(dá)模式。

Ki-67是一種檢測細(xì)胞增殖的標(biāo)志物,在除G0期外所有細(xì)胞周期上都有表達(dá)，它在非腫瘤性宮頸鱗狀上皮中限于基底層及副基底層。HPV感染會導(dǎo)致上皮細(xì)胞增殖，且以往的研究顯示Ki-67染色的強(qiáng)度與宮頸鱗狀上皮異型增生的級別呈正比[10]。雖在本研究中Ki-67在LSIL組和HSIL均有很高的陽性表達(dá)率，但在染色細(xì)胞數(shù)量和分布模式上有很大不同。Ki-67在LISL組病例中的染色細(xì)胞不僅數(shù)量上以1+為主，而且染色細(xì)胞主要位于上皮層的下1/3，中上層僅個別細(xì)胞表達(dá)，而在HSIL組中Ki-67染色細(xì)胞數(shù)量上以2+及以上為主，且上皮層1/3以上、甚至全層有大量染色細(xì)胞分布。因此在對宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變進(jìn)行診斷時，對Ki-67染色結(jié)果的判斷應(yīng)著重于判斷Ki-67染色細(xì)胞數(shù)量和分布模式。

本研究也發(fā)現(xiàn)若單獨(dú)行P16免疫組織化學(xué)檢測，雖大部分LSIL和HSIL病變能得到明確區(qū)分，但部分LSIL和HSIL病變的P16在表達(dá)強(qiáng)度上存在重疊。文獻(xiàn)報道在病理形態(tài)典型的 LSIL 中，大約有 1/3 病例顯示累及基底層和副基底層的彌漫性 P16 免疫染色[11]。因此P16 陽性不能作為判讀 HISL 的絕對指征，在宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變中單獨(dú)行P16免疫組織化學(xué)檢測將會影響診斷的準(zhǔn)確性。本研究發(fā)現(xiàn)Ki-67染色細(xì)胞的數(shù)量和分布模式在LSIL和HSIL中有明顯不同。在HSIL組中Ki-67染色細(xì)胞的數(shù)量以2+及以上為主，且上皮層1/3以上、甚至全層有大量染色細(xì)胞分布。以Ki-67 2+及以上表達(dá)為標(biāo)準(zhǔn)將P16 1+表達(dá)的宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變判為HSIL，可對這部分病例做進(jìn)一步區(qū)分，降低診斷不明的病例數(shù)比率。因此P16和Ki-67免疫組織化學(xué)聯(lián)合檢測在宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變中具有重要的診斷價值。

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