少孢節(jié)叢孢菌XJ-A1幾丁質(zhì)酶基因AO-587和AO-31的克隆及分子特征分析

鐘文強(qiáng)，孟慶玲*，喬 軍，陳 英，貢莎莎，王熙鳳，才學(xué)鵬

(1.石河子大學(xué) 動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730046)

少孢節(jié)叢孢菌是目前研究最多的一種捕食線蟲性真菌[1]，在自然界中廣泛分布。研究表明，幾丁質(zhì)(Chitin)是許多線蟲體壁和蟲卵外殼的主要成分[2]，來源于致病性真菌的幾丁質(zhì)酶能催化幾丁質(zhì)水解，而捕食線蟲性真菌在侵染線蟲過程中分泌的胞外水解酶中就含有幾丁質(zhì)酶，可能參與線蟲表皮的侵入和宿主細(xì)胞的降解[3-6]。研究顯示，少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶在侵染線蟲過程中發(fā)揮重要作用[3-8]。從新疆地區(qū)分離到的捕食線蟲性真菌主要為少孢節(jié)叢孢菌[9-11]，因此，對少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)及其在侵染線蟲過程中的研究具有重要意義。

本研究根據(jù)GenBank中公布的少孢節(jié)叢孢菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 24927)全基因組[12]，從少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株中對幾丁質(zhì)酶基因AO-587和AO-31進(jìn)行克隆、測序，對基因及其編碼氨基酸序列的分子進(jìn)行特征性分析，并將這2個(gè)基因與致病性相關(guān)的真菌幾丁質(zhì)酶進(jìn)行同源性比對以及系統(tǒng)進(jìn)化分析，為進(jìn)一步研究少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶在侵染線蟲過程中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑、及培養(yǎng)基

捕食線蟲性真菌少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株XJ-A1(ArthrobotrysoligosporaXJ-A1)和E.coliDH5α菌株由石河子大學(xué)寄生蟲實(shí)驗(yàn)室保存；2×Taq PCR 反應(yīng)試劑、5 000 bp DNA Marker均購自索來寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、pMD19-T載體與Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司。YPSSA(yeast-phosphate-sulfate-soluble starch-agar)培養(yǎng)基：0.8 g酵母提取物、0.2 g K2HPO4·3H2O、0.1 g MgSO4、4 g可溶性淀粉、4 g瓊脂，加蒸餾水至200 mL，經(jīng)高壓滅菌后傾注于滅菌玻璃培養(yǎng)皿，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA的提取

向YPSSA培養(yǎng)基中加入適量少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株XJ-A1，在20 ℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 d。取適量菌絲，用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank發(fā)表的少孢節(jié)叢孢菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 24927)全基因組序列，利用Primer 5.0 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)幾丁質(zhì)酶基因AO-587和AO-31的特異性引物：AO-587(上游)：5' ATGAAAACAATTACTATCGC 3'；AO-587(下游)：5' CTAATCATAACTAGGGGATC 3'；AO-31(上游)：5' ATGGAAGCTCAAG 3'；AO-31(下游)：5' CTACCGCTGATTTCTAA 3'，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.4 幾丁質(zhì)酶基因的PCR擴(kuò)增和克隆

PCR擴(kuò)增體系為20 μL：其中DNA模板2 μL、PCR Mixture 8 μL、上下游引物各0.5 μL、ddH2O 9 μL。AO-587基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 120 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。AO-31基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，62℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。得到的DNA產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。將回收的目的基因片段克隆到pMD18-T載體上，16 ℃過夜連接后轉(zhuǎn)入到E.coliDH5α菌株中，涂布在含有100 mg/ml Amp的固體LB培養(yǎng)基上，挑單菌落擴(kuò)增培養(yǎng)，提質(zhì)粒后經(jīng)PCR鑒定，將提取的質(zhì)粒交送北京六合華大股份有限公司測序。

1.5 幾丁質(zhì)酶基因及其編碼氨基酸序列生物信息學(xué)分析

測序結(jié)果利用生物在線軟件ProParam (http://web.expasy.org/protparam/)計(jì)算蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等；通過(http://www.expasy.org/tools/，http://www.ebi.ac.uk/interpro/)分析幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域、氨基酸活性位點(diǎn)；通過SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測信號肽；通過Predictprotein和Phyre2預(yù)測二級、三級結(jié)構(gòu)。采用DNAMAN和MEGA5.0軟件NJ法(Neighbor-joining Method，bootstrap為1000)進(jìn)行氨基酸序列的同源性比對和進(jìn)化分析。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

少孢節(jié)叢孢菌XJ-A1的DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果表明，少孢節(jié)叢孢菌XJ-A1幾丁質(zhì)酶AO-587基因約為1 930 bp，AO-31基因約為1 171 bp，與GenBank中已公布的少孢節(jié)叢孢菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 24927)AO-587和AO-31基因大小相近(圖1)。

圖1 少孢節(jié)叢孢菌XJ-A1幾丁質(zhì)酶基因AO-587和AO-31的PCR擴(kuò)增M1. DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL-5000；M2.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL-2000；1-3. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Amplification products of chitinases AO-587 and AO-31 gene of Arothrobotrys oligospora XJ-A1 by PCRM. DL-5000 DNA Marker;M2. DL-2000 DNA Marker;1-3. PCR amplified product

2.2 少孢節(jié)叢孢菌XJ-A1幾丁質(zhì)酶AO-587和AO-31基因及其編碼氨基酸序列分析

測序結(jié)果表明，少孢節(jié)叢孢菌XJ-A1幾丁質(zhì)酶AO-587基因全長為1 930 bp，與已公布的少孢節(jié)叢孢菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 24927)的幾丁質(zhì)酶AO-587核苷酸序列的同源性為94.43%。序列中包含4個(gè)內(nèi)含子和一個(gè)1 560 bp的開放閱讀框(ORF)，內(nèi)含子都以GT開頭，AG結(jié)尾，分別位于319～419、549～690、929～999、1696～1780位核苷酸，具有真菌內(nèi)含子的共同特征；外顯子編碼519個(gè)氨基酸，與已公布的氨基酸序列同源性為93.25%。通過SignalP軟件分析發(fā)現(xiàn)，AO-587氨基酸序列有信號肽序列，位于氨基酸序列的第1～22位。Protparam軟件預(yù)測幾丁質(zhì)酶AO-587的分子量為55.86 kD，等電點(diǎn)為4.94；Interpro和Scanprosite軟件分析發(fā)現(xiàn)，AO-587存在2個(gè)幾丁質(zhì)酶保守的區(qū)域SVGG和DGLDLDWE，屬于糖苷水解酶18家族，主要催化活性區(qū)域位于105～364位，并且存在一個(gè)水解酶催化活性位點(diǎn)DGLDLDWE，位于234～241位(圖2)。

AO-31基因全長為1 173 bp，與已公布的少孢節(jié)叢孢菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 24927)的幾丁質(zhì)酶AO-31核苷酸序列的同源性為99.64%；序列中包含3個(gè)內(nèi)含子和一個(gè)900 bp的開放閱讀框(ORF)，內(nèi)含子都以GT開頭，AG結(jié)尾，分別位于166～233、251～324、723～788位核苷酸，具有真菌內(nèi)含子的共同特征序列；外顯子編碼299個(gè)氨基酸，與已公布的氨基酸序列同源性為100% 。經(jīng)SignalP軟件分析發(fā)現(xiàn)，AO-31氨基酸序列沒有信號肽。Protparam軟件預(yù)測幾丁質(zhì)酶AO-31的分子量為34.6 kD，等電點(diǎn)為5.86；Interpro 和Scanprosite軟件分析發(fā)現(xiàn)，AO-31存在2個(gè)幾丁質(zhì)酶保守區(qū)域ICFVG和IRRDWEY，屬于糖苷水解酶18家族，幾丁質(zhì)酶主要催化的活性區(qū)位于10-275位，存在一個(gè)水解酶催化活性位點(diǎn)IRRDWEY，位于53～59位(圖3)。

圖2 不同真菌來源幾丁質(zhì)酶主要催化活性區(qū)域氨基酸序列比對*表示幾丁質(zhì)酶的結(jié)合區(qū)域(ENGVMDYKA，GLCCGMWWETSG)與糖基水解酶18家族保守的水解區(qū)域(SXGG，DGXDXDWE)；灰色的部分為高度同源(100%)區(qū)域Fig.2 Comparison of amino acid sequence of major catalytic active regions of chitinase from different fungi* indicates the binding region of chitinase (ENGVMDYKA, GLCCGMWWETSG) and the conserved hydrolysis zone of the sugar-based hydrolase 18 family (SXGG, DGXDXDWE)；grey part is part of the highly homologous (100%) region

2.3 幾丁質(zhì)酶二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

Predictprotein軟件預(yù)測結(jié)果顯示，幾丁質(zhì)酶AO-587和AO-31的二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲(loop)、α螺旋(alpha-helix)和β折疊(beta-sheet)為結(jié)構(gòu)元件，在AO-587二級結(jié)構(gòu)中分別占17.7%、15.6%、66.7%，在AO-31二級結(jié)構(gòu)中分別占28.1%、16.4%、55.5%。SWISS-MODEL軟件預(yù)測結(jié)果顯示，幾丁質(zhì)酶AO-587和AO-31三級結(jié)構(gòu)都具有(α/β)8的圓桶形結(jié)構(gòu)，其外部由α螺旋形成外桶，中心部分由β折疊形成內(nèi)桶，內(nèi)外桶緊密連接(圖4)。

圖3 少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO-587和AO-31基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域模式圖Fig.3 Domain pattern of chitinase AO-587 and AO-31 gene encoding protein of Arthrobotrys oligospora

圖4 AO-587和AO-31幾丁質(zhì)酶三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig. 4 Prediction of the tertiary structures of AO-587 and AO-31 chitinase

2.5 不同物種來源幾丁質(zhì)酶的系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用MEGA5.0軟件對28個(gè)不同來源的幾丁質(zhì)酶氨基酸序列繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示(圖5)，各菌株序列形成3個(gè)明顯的分枝，其中，第1個(gè)分枝的幾丁質(zhì)酶分子質(zhì)量約為47 ku，第2個(gè)分枝的幾丁質(zhì)酶分子質(zhì)量約為41 ku，第3個(gè)分枝的幾丁質(zhì)酶分子質(zhì)量約為52 ku。少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株幾丁質(zhì)酶AO-31分為單獨(dú)的一個(gè)小分枝，AO-587位于第3個(gè)分枝和Drechslerellsstenobrocha以及Dactylellinahaptotyla的幾丁質(zhì)酶親緣關(guān)系最接近說明他們具有相似的結(jié)構(gòu)和功能。

3 討 論

目前，多種侵染性分子(毒素、胞外酶、病原物激素、病原物胞外多糖等)在捕食線蟲性真菌——線蟲相互作用的過程中被先后發(fā)現(xiàn)，尤其是絲氨酸蛋白酶和幾丁質(zhì)酶在侵入線蟲表皮和降解宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮著重要作用[3-8]。有關(guān)捕食線蟲性真菌產(chǎn)生胞外蛋白酶及其酶學(xué)性質(zhì)的研究于20世紀(jì)80年代才開始出現(xiàn)[14]，之后對蛋白酶基因的研究較多，而國內(nèi)外對捕食線蟲性真菌幾丁質(zhì)酶相關(guān)基因的報(bào)道卻比較少。少孢節(jié)叢孢菌(Arthrobotrysoligospora)是捕食線蟲性真菌的代表菌[1]，在自然界中廣泛分布?，F(xiàn)有研究資料表明，少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶在侵染線蟲過程中發(fā)揮重要作用[3-8]。幾丁質(zhì)(Chitin)是許多線蟲體壁和蟲卵外殼的主要成分，是由N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖以β-1, 4糖苷鍵連接而成的高分子生物多聚體，而幾丁質(zhì)酶能催化幾丁質(zhì)β-1, 4糖苷鍵水解[2]。因此，研究少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶在侵染線蟲過程中發(fā)揮的作用具有重要意義。

本研究以捕食線蟲真菌的模式菌-少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株XJ-A1為研究對象，對少孢節(jié)叢孢幾丁質(zhì)酶AO-587和AO-31進(jìn)行克隆，成功獲得兩個(gè)全長編碼基因序列，與少孢節(jié)叢孢菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 24927)的幾丁質(zhì)酶AO-587和AO-31基因核苷酸序列同源性分別為94.43%、99.64%，氨基酸序列同源性分別為93.25%和100%?？芍煌蛛x株的捕食線蟲性真菌少孢節(jié)叢孢菌之間存在一定的差異?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)不同來源真菌的幾丁質(zhì)酶具有相似的幾丁質(zhì)酶催化域、信號肽、幾丁質(zhì)結(jié)合域等結(jié)構(gòu)域[13,15-16]。本研究利用Interpro和Scanprosite軟件進(jìn)行幾丁質(zhì)酶AO-587、AO-31氨基酸序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，AO-587的幾丁質(zhì)酶主要催化活性區(qū)域位于105～364位，AO-31的幾丁質(zhì)酶主要催化活性區(qū)位于10～275位。并且XJ-A1幾丁質(zhì)酶均具有典型的幾丁質(zhì)酶催化區(qū)保守序列SXGG和DGXDXDWE，與Wright等[17]和Cantarel等[18]的研究結(jié)果一致。從幾丁質(zhì)酶的系統(tǒng)進(jìn)化分析可以看出，少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株幾丁質(zhì)酶AO-587、AO-31和Drechslerellsstenobrocha以及Dactylellinahaptotyla的幾丁質(zhì)酶親緣關(guān)系最接近。目前，在Drechslerellsstenobrocha以及Dactylellinahaptotyla中已報(bào)道有多種糖苷水解酶18家族幾丁質(zhì)酶或假定的幾丁質(zhì)酶基因[21]，參考這些在進(jìn)化上存在相關(guān)性的幾丁質(zhì)酶將更有利于深入開展少孢節(jié)叢孢菌相關(guān)幾丁質(zhì)酶功能研究。

圖5 不同真菌來源幾丁質(zhì)酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹*為新疆分離株少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO-31、AO-587Fig.5 Phylogenetic tree of chitinase from different fungi sources* means the Xinjiang isolates, respectively, and the chitinase AO-31 and AO-587

新疆是我國主要的牧區(qū)，家畜線蟲病對新疆養(yǎng)羊業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。采取化學(xué)藥物防控該病時(shí)產(chǎn)生的抗藥性、藥物殘留、環(huán)境污染等問題日益嚴(yán)重，利用寄生性線蟲的天敵-捕食線蟲性真菌進(jìn)行生物防治具有良好的應(yīng)用前景，因此開展捕食線蟲性真菌的研究至關(guān)重要。隨著對少孢節(jié)叢孢菌胞外蛋白酶分子生物學(xué)研究的深入，為研究和開發(fā)基于其胞外蛋白酶(幾丁質(zhì)酶和絲氨酸蛋白酶)的生物防控制劑提供科學(xué)依據(jù)。

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