評估SDS在MALDI-TOF MS直接鑒定陽性血培養(yǎng)樣本中的應(yīng)用價值

周春妹， 沈佳瑾， 黃聲雷， 馬 艷，李華茵

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科， 上海 200032）

快速、準(zhǔn)確鑒定血流感染病原菌是微生物實驗室的一項重要工作。血培養(yǎng)報陽后傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)種和生化表型鑒定方法至少需要48 h，而通過對血培養(yǎng)陽性樣本的前處理，借助基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）可以快速得到細(xì)菌鑒定結(jié)果，大大縮短報告時間，從而滿足臨床快速診斷的需求。本研究通過對陽性血培養(yǎng)前處理方法改良前后的鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，以尋求更高效的血培養(yǎng)直接鑒定方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 血培養(yǎng)陽性樣本 收集2016年3—9月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院微生物室血培養(yǎng)陽性樣本378份，同一患者的不同血培養(yǎng)瓶均入選本研究。

1.1.2 試劑和儀器 BACTEC FX血培養(yǎng)系統(tǒng)和配套的樹脂血培養(yǎng)瓶、溶血素血培養(yǎng)瓶、真菌血培養(yǎng)瓶及分離膠促凝管均購自美國BD公司。MALDI-TOF MS儀、α-氰基-4-羥基肉桂酸（alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid ，CHCA）基質(zhì)液、甲酸基質(zhì)液、64孔靶板、MS細(xì)菌數(shù)據(jù)庫（版本V2.0）及血瓊脂平板購自法國生物梅里埃公司。十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、甲酸、乙腈、無水乙醇購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 MALDI-TOF MS直接鑒定前處理 選擇鏡檢陽性的血培養(yǎng)樣本進(jìn)行MALDI-TOF MS直接鑒定前處理，鏡檢陰性的血培養(yǎng)樣本則不再進(jìn)行MALDI-TOF MS直接鑒定。

1.2.2 改良前的前處理方法 抽取5 mL陽性樣本轉(zhuǎn)入分離膠促凝管內(nèi)，以1 308×g低速離心10 min，棄去上清，將分離膠邊緣灰白色沉淀物（菌體富集物）挑取后放入含300 μL蒸餾水的Eppendorf管中，加無水乙醇900 μL，混勻。以19 000×g高速離心2 min。徹底去除上清，向沉淀物中加入70%甲酸50 μL和100%乙腈50 μL，混勻。以19 000×g高速離心2 min。取上清1.5 μL備用。

1.2.3 改良后的前處理方法 陽性血培養(yǎng)樣本按照之前的方法先離心，用1 000 μL蒸餾水洗滌分離膠邊緣的灰白色沉淀物，并將菌懸液轉(zhuǎn)移至 Eppendorf管中。以19 000×g高速離心2 min。棄去上清，沉淀加0.1%SDS 1 000 μL，充分混勻、洗滌。以19 000×g高速離心2 min。棄去上清，向沉淀物中加蒸餾水再次洗滌。高速離心后棄去上清，將沉淀物溶于300 μL蒸餾水和90 0 μL無水乙醇中，后續(xù)的步驟同前。

1.2.4 陽性血培養(yǎng)樣本的常規(guī)轉(zhuǎn)種與培養(yǎng) 挑取陽性血培養(yǎng)樣本，轉(zhuǎn)種血瓊脂平板，置35 ℃、CO2環(huán)境中過夜培養(yǎng)。

1.2.5 MALDI-TOF MS鑒定 將標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌（ATCC 8739）（由法國生物梅里埃公司提供）涂在靶板的校準(zhǔn)點位中，挑取0.5～1個菌落涂在靶板的點位中，取1.5 μL已前處理的上清液（直接鑒定的樣本）滴入靶板的點位中，待干燥。鏡檢或培養(yǎng)為細(xì)菌者加1 μL CHCA基質(zhì)液；鏡檢或培養(yǎng)為酵母者加0.5 μL 甲酸基質(zhì)液，室溫干燥后，再加1 μL CHCA基質(zhì)液，室溫干燥。校準(zhǔn)點位加1 μL CHCA基質(zhì)液，干燥后放入MALDI-TOF MS儀，儀器自動獲取病原菌全細(xì)胞蛋白質(zhì)譜，將待測菌質(zhì)譜與MS細(xì)菌數(shù)據(jù)庫中的質(zhì)譜進(jìn)行比較、分析從而獲得鑒定結(jié)果。本實驗直接鑒定如出現(xiàn)與菌落鑒定不符合的結(jié)果，以純菌落MALDI-TOF MS的鑒定結(jié)果為最終結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 2.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，率的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 未使用和使用SDS洗滌的樣本的檢測

未使用SDS洗滌的樣本90例，剔除3例純菌落MALDI-TOF MS無結(jié)果的樣本，單種細(xì)菌感染的血樣本83例，種鑒定準(zhǔn)確率為73.5%，有4例為復(fù)數(shù)菌感染。使用SDS洗滌的樣本288例，剔除2例菌落MALDI-TOF MS無結(jié)果的樣本，單種細(xì)菌感染的血樣本277例，種鑒定準(zhǔn)確率為82.7%，有9例為復(fù)數(shù)菌感染。

2.2 未使用和使用SDS洗滌的樣本各類病原菌的檢測

使用SDS洗滌樣本后MALDI-TOF MS對革蘭陽性球菌和酵母的鑒定準(zhǔn)確率有明顯增加（P＜0.05），見表1。 改良后葡萄球菌的鑒定準(zhǔn)確率從62.5%增加至95.6%，鏈球菌的鑒定準(zhǔn)確率從33.3%增加至90.0%，一些少見菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、紋帶棒狀桿菌和人蒼白桿菌等都得到很好的鑒定，見表2。

2.3 復(fù)數(shù)菌的檢測

本研究收集復(fù)數(shù)菌感染共13例。改良前4例，有1例2種菌都得到鑒定結(jié)果，還有1例只鑒定出一種病原菌，另有2例無鑒定結(jié)果。改良后收集到9例復(fù)數(shù)菌感染的血樣本，有6例鑒定正確，有3例只鑒定出1種病原菌，鑒定準(zhǔn)確率從25.0%增加至66.6%。見表3。

表1 未使用與使用SDS洗滌的樣本鑒定結(jié)果的比較

表2 未使用與使用SDS洗滌的樣本各類病原菌鑒定結(jié)果的比較

續(xù)表2

表3 未使用與使用SDS洗滌樣本復(fù)數(shù)菌鑒定結(jié)果的比較

3 討論

MALDI-TOF MS是一種新興的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測技術(shù)，是微生物鑒定的新技術(shù)，因其具有快速、準(zhǔn)確和操作簡便等特點而在微生物實驗室得到廣泛應(yīng)用。通過病原菌富集技術(shù)處理陽性血培養(yǎng)樣本后直接用MALDI-TOF MS進(jìn)行鑒定，將會極大地提高鑒定速度，縮短報告時間，滿足臨床快速診斷的需求。

在陽性血培養(yǎng)樣本直接鑒定中，前處理是關(guān)鍵步驟，對鑒定結(jié)果有直接影響。有文獻(xiàn)顯示目前富集菌體的前處理方法較多，有分離膠促凝管法、濾膜吸附法和差速離心法等，每種方法都有各自的特點，亦有較好的鑒定效果[1-3]。但限于某些研究方法需要添置特殊儀器或增加研究成本，本研究使用了分離膠促凝管法的前處理方法，該方法不需要另添置儀器，操作也較為簡便。

有文獻(xiàn)顯示，使用分離膠促凝管法富集菌體鑒定對革蘭陽性菌的鑒定準(zhǔn)確率為60.0%～79.7%，革蘭陰性菌的鑒定準(zhǔn)確率為86.6%～86.9%[4-6]。也有在使用分離膠的基礎(chǔ)上通過方法的改進(jìn)使鑒定準(zhǔn)確率增加的介紹[7]。本研究未使用SDS洗滌的樣本革蘭陽性菌的鑒定準(zhǔn)確率為65.7%，革蘭陰性桿菌為92.3%，但在革蘭陽性球菌中除腸球菌屬有較好的鑒定準(zhǔn)確率外，葡萄球菌屬和鏈球菌屬的鑒定準(zhǔn)確率均不理想，分別僅為62.5%和33.3%，酵母的鑒定準(zhǔn)確率則更低，僅11.1%。為得到更好的鑒定準(zhǔn)確率，更有效地協(xié)助臨床診斷感染，在本研究后期對前處理方法進(jìn)行修改，增加了SDS的洗滌過程。SDS是一種溫和去污劑，有相關(guān)文獻(xiàn)報道SDS可用于血培養(yǎng)念珠菌陽性的處理，可溶解血液中的血細(xì)胞，通過離心和洗滌去除其他干擾因素，純化要鑒定的細(xì)菌，增加鑒定的正確率[8]。通過SDS洗滌，葡萄球菌屬的鑒定準(zhǔn)確率增加至95.6%，鏈球菌屬的鑒定準(zhǔn)確率增加至90.0%，酵母的鑒定準(zhǔn)確率也增加至50.0%，其中在23株近平滑念珠菌中有18株得到正確鑒定。而革蘭陰性桿菌的鑒定準(zhǔn)確率略有降低，可能和后期出現(xiàn)的15株沙門菌鑒定準(zhǔn)確率較低有關(guān)。在復(fù)數(shù)菌的鑒定中，經(jīng)過SDS洗滌，鑒定準(zhǔn)確率也有大幅度增加，9例中有6例正確鑒定出2種病原菌。當(dāng)然本研究復(fù)數(shù)菌的例數(shù)較少，混合菌種類型較少，還需更多的數(shù)據(jù)來證明。

本研究結(jié)果表明，在陽性血培養(yǎng)的直接鑒定中，用分離膠促凝管法富集菌體后增加SDS的洗滌處理，操作簡單，對增加MALDI-TOF MS的鑒定準(zhǔn)確率有較大幫助，值得在臨床微生物實驗室推廣。

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