2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯高效液相色譜定量分析方法的建立

孔英戈，汪 華，張少云，潘 萍

（衡陽市食品藥品檢驗檢測中心，湖南 衡陽 421001）

巴氯芬（baclofen，氯苯氨丁酸）為解痙藥，是γ-氨基丁酸（GABA）的衍生物，為作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦和脊髓的骨骼肌松弛劑、鎮(zhèn)靜劑[1]。巴氯芬是第一個應用于臨床的選擇性GABAB受體激動劑，曾作為肌松藥用于臨床，近年來又發(fā)現(xiàn)了許多新的應用，如鎮(zhèn)咳、抗癲癇、治療頑固性呃逆、中風及脊髓損傷引起的疼痛、三叉神經(jīng)痛等。在腦血管病康復期，應用巴氯芬也取得良好效果，采用巴氯芬治療胃食管反流病開辟了非抑胃酸治療胃食管反流病的新途徑[2]。巴氯芬的結構式為：

2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯是合成巴氯芬的關鍵中間體[3]，其含量和穩(wěn)定性直接決定最終產(chǎn)物巴氯芬的質(zhì)量和產(chǎn)量，而目前未見該中間體相關分析方法的報道。因此，研究巴氯芬關鍵中間體2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯的定量分析檢測方法是非常必要和重要的。2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯的結構式為：

高效液相色譜法（HPLC）是色譜分析法的一個分支，是近年來藥物分析中發(fā)展較快，已占主導地位的分離、分析方法[4-7]。其特點是分析速度快、分離效率高、檢測靈敏度高、適用范圍廣、組分易回收等，現(xiàn)已廣泛應用于藥物成分含量測定、組成分析和質(zhì)量控制等方面[8]。本研究采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC），利用二極管陣列檢測器（DAD）定量檢測分析巴氯芬的關鍵中間體2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫1260 Infinity四元液相色譜系統(tǒng)，包括1260 Quat pump（四元低壓混合泵）、在線真空脫氣機、1260 ALS自動液體進樣器、1260 TCC柱溫箱和1260DAD全波長掃描檢測器；全玻璃溶劑過濾器AUTO SCIENCE。

甲醇：色譜純（HPLC級），經(jīng)0.2 μm孔徑油相濾膜過濾處理；水：實驗室二級純水，經(jīng)0.2 μm孔徑水相濾膜過濾處理；2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯標準品（純度大于99.0%）。

1.2 色譜條件

色譜柱：WAT054275 Waters Symmetry（ 250 mm×4.6 mm，5 μm）不銹鋼柱，內(nèi)裝C18（5μm）鍵合固定相；流動相：甲醇-水（70+30）；紫外檢測波長：319 nm；柱溫：40.0℃；流量：1 mL/min；進樣量：20.0 μL；典型保留時間：7.5 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜柱的選擇

為實現(xiàn)目標化合物的有效分離與測定，滿足檢測重現(xiàn)性要求，比較和選擇適宜目標化合物的色譜柱。試驗選擇比較了WAT054275 Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、SB（Stable Bond） C18色 譜 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、XDB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、島津C18色 譜 柱（250 mm×4.6 mm，5μm）、Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）等色譜柱。結果發(fā)現(xiàn)，WAT054275 Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 分 離峰 對 稱性 較好，重現(xiàn)性較優(yōu)異。本工作選擇WAT054275 Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）為分離分析柱。

1.3.2 標準溶液的制備

2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯標準溶液的配制：稱取約0.05 g（準確到0.000 2 g）2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯標準樣品置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解，超聲處理后，待樣品完全溶解并冷卻至室溫后用甲醇定容。搖勻后，用移液管準確移取1.0 mL溶液于另一只25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，振蕩搖勻。用0.45 μm濾膜過濾備用。

1.3.3 試樣溶液的配制

試樣溶液的配制：稱取約0.05 g（準確到0.000 2 g）2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯待測樣品置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解，超聲處理后，待樣品完全溶解并冷卻至室溫后用甲醇定容。搖勻后，用移液管準確移取1.0 mL溶液于另一只25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，振蕩搖勻。用0.45 μm濾膜過濾備用。

在上述條件下，待儀器狀態(tài)穩(wěn)定后，連續(xù)注入幾針標樣溶液，計算各針相應值的重復性，待相鄰兩針的相對響應值變化小于0.5%以后，按標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液順序進行色譜分析。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

按色譜條件對樣品溶液及標準溶液進行測定，其色譜圖如圖1所示。

圖1 2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯的液相色譜圖

2.2 檢測波長的選擇

經(jīng)190～590 nm全波段掃描，2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯在200～250 nm范圍內(nèi)都有較強的紫外吸收（見圖2），在319 nm左右處吸收最強且此時雜質(zhì)和主峰吸收均較理想。因此，選擇319 nm為其檢測波長。

2.3 流動相的選擇

試驗發(fā)現(xiàn)，2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯在流動相甲醇-水（30:70）時，保留時間較短，甲醇-水（5:95）時，保留時間長，分離效果較差；在比例為（10:90）時能6 min內(nèi)出峰，但分離效果和峰形不好。在甲醇-水（70:30）時，無論是保留時間、分離效果還是峰形都比較好。因此，試驗選擇甲醇-水為流動相，流動相比為（70:30）。

圖2 2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯的紫外掃描光譜圖

2.4 方法的線性范圍

按照1.3.2稱取0.05 g標準品配制成溶液后分別用移液管準確移取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容并搖勻過濾。在1.2色譜條件下測定，其結果如表1所示。

表1 線性關系的測定結果

根據(jù)表1結果繪制線性回歸曲線，如圖3所示。線性方程為y=106x+252 987，相關系數(shù)r2=0.999 5，從中可看出方法的線性范圍較寬。

圖3 2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯標準曲線

2.5 精密度的測定

用同一樣品在色譜條件下進行多次重復測定，結果如表2所示。表2結果說明，該方法的精密度較好。

2.6 回收率的測定

將2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯標準樣品加入已知2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯含量的樣品中，在色譜條件下測定其回收率，結果如表3所示。

從表3可知，回收率在98.6%～100.8%，說明方法的準確性很好。綜合以上試驗結果，采用高效液相色譜法，能夠滿足對2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯的定量分析要求。

表2 精密度的測定結果

表3 回收率的測定結果

3 結論

本文采用高效液相色譜法建立了2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯的外標法定量分析方法。該方法利用WAT054275 Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動相為甲醇-水（70:30），流速1 mL/min，使用二極管陣列檢測器于319 nm測定，并且樣品雜質(zhì)不干擾測定。這種方法的標準偏差為0.34%，變異系數(shù)為0.35%，線性范圍較寬，相關系數(shù)為0.999 7，樣品加標回收率為98.6%～100.8%，定量分析檢測結果滿意。

1 謝瑞滿.巴氯芬臨床應用研究進展[J].世界臨床藥物，2006，（3）：149-153.

2 汪萌芽，朱 蓉.解痙藥巴氯芬研究進展[J].中國藥理學通報，1992，（5）：335-339.

3 端振英.R（-）-巴氯芬的合成及中間體（±）-GAM的拆分[D].河北：河北醫(yī)科大學，2003.

4 成都科學技術大學分析化學教研室.分析化學手冊（第四冊下冊 光譜分析）[M].北京：化學工業(yè)出版社，1984.

5 The United States Pharmacopeial Convention.The United States Pharmacopoeia X XⅢ[S].Washington，DC：The United States Pharmacopeial Convention，2012.

6 British Pharmacopoeia Commission.British Phavmacopia[S].London：British Pharmacopoeia Commission，2002.

7 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

8 竹葉晉，張 杰.HPLC-EISD在藥物分析中的應用進展[J].贛南師范學院學報，2003，12（6）：39-41.