鈍藥野木瓜中三萜類化合物分離及其含量測定

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1.貴陽中醫(yī)學院藥學系，貴州 貴陽 550002；2.貴州師范大學分析測試中心, 貴州 貴陽 550001；3.黔南州甕安縣人民醫(yī)院, 貴州 黔南 550400

鈍藥野木瓜(StauntonialeucanthaDiels ex Y.C.)屬于木通科野木瓜屬植物，俗稱繞繞藤、五葉木通、八月瓜，主要分布在貴州、四川、安徽、江浙和兩廣一帶，具有祛風止痛，利尿消腫的功效，對風濕痹通、小便不利和水腫療效顯著[1]。該藥材被2003版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》收載，作為野木瓜藤入藥，但僅有性狀描述[2]。在長期研究抗病毒中藥和民族藥的過程中，采用HIV-1蛋白酶和HPLC法[3]，發(fā)現鈍藥野木瓜95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物在100 μg/mL時，對HIV蛋白酶的抑制率達44.3%，進一步的文獻調研發(fā)現，鈍藥野木瓜化學成分及含量研究未見報道。2015 版《中國藥典》同屬植物野木瓜(S.chinensisDC)以苯乙醇苷類成分荷苞花苷B作為指標性成分進行質量控制[4]。本課題組參照藥典方法對黔產10批次的鈍藥野木瓜藥材中荷苞花苷B進行定性和定量研究，發(fā)現含量為5.91～39.39 μg/g，荷苞花苷B需低溫存放，長時間暴露在空氣中，含量有所下降，其標準品溶液低溫存放超過24 h后，易產生雜質峰[5]。一些學者對野木瓜(S.chinensisDC)中的木犀草素、綠原酸、齊墩果酸和熊果酸的含量進行了報道[6-8]，而同屬植物化學成分研究發(fā)現野木瓜(S.chinensisDC)[9]、六葉野木瓜(S.hexaphyllaThunb.Dence.)、五指那藤(S.obovatifoliolasubsp.intermedia)、尾葉那藤(S.obovatifoliolasp.urophylla)和黃臘果(S.brachyanthera)藤莖中常分離出羽扇豆醇和羽扇豆酮等多種羽扇豆烷型化合物[9-11]。體內外研究證實，羽扇豆醇具抗炎、抗瘧疾、抗癌等作用[12]。羽扇豆酮對單純皰疹病毒(HSV)和非洲豬瘟病毒(ASFV)具有抗病毒活性，對HSV-1和HSV-2具有很強的抗病毒抑癍作用[13]。為明確鈍藥野木瓜藥效物質基礎，實驗開展了鈍藥野木瓜化學成分研究，建立HPLC法同時測定羽扇豆醇和羽扇豆酮的定量分析方法，為該藥材的監(jiān)督、質控和相關藥品、保健品的開發(fā)研制提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Bruker AM-400和500 MHz核磁共振波譜儀(TMS為內標)；GC-MS 5973型氣相色譜質譜聯(lián)用儀(美國HP公司)；1100型高效液相色譜儀( 美國 Agilent)；梅特勒-托利多超聲波清洗器(METILER-TOULEDO)；ME104 電子分析天平(瑞士梅特勒)；R-200旋轉蒸發(fā)儀(瑞士布奇公司)；SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵(上海予英儀器有限公司)；ZF-1三用紫外分析儀(上海電光分析)。

1.2 材料 TLC和柱色譜硅膠分別為GF254和200-300目硅膠 (青島海洋化工廠分廠)；反相硅膠為ODS DM 1020T (日本富士硅膠公司)；Sephadex LH-20 (GE 公司)。羽扇豆醇、羽扇豆烷均來自為本植物(乙酸乙酯萃取)分離純化所得，結構經波譜學(ESI-MS，1H-NMR，13C-NMR)分析鑒定，以HPLC面積歸一化法測定其質量分數均大于96%。洗脫劑均為工業(yè)重蒸品，甲醇、乙醇、磷酸(分析純，重慶茂業(yè)化學試劑有限公司)；乙腈(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；水(超純水)。鈍藥野木瓜藥材于2014年4月采集于貴州省遵義市，經貴陽中醫(yī)學院陳德媛教授鑒定為鈍藥野木瓜的地上部分，憑證標本保存于貴陽中醫(yī)學院中藥化學教研室(標本號：2014/SL)。

2 方法與結果

2.1 化學成分研究

2.1.1 藥材前處理 干燥鈍藥野木瓜藤莖 3 kg,粉碎后用70%的甲醇溶液(料液比為 1∶3)加熱回流提取3次，每次1 h，合并浸提液后減壓濃縮，回收甲醇至無醇味，再用乙酸乙酯萃取，濃縮，得浸膏(45 g)，經硅膠柱(柱長×內徑=75 cm × 5.5 cm )色譜進行分離。以石油醚-乙酸乙酯(40∶1 → 0∶100)進行梯度洗脫，最后用氯仿-甲醇(1∶1)混合液及純甲醇下柱，得 35 個流份(fr.1～ 35)。

2.1.2 化合物的分離純化 在fr.3，即 石油醚-乙酸乙酯 25∶1 部分(112 mg)經Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，以氯仿-甲醇(1∶1)為洗脫劑，純化得到化合物 1(27 mg)；fr. 18，即石油醚-乙酸乙酯 20∶1～18∶1部分(106 mg)經反相硅膠柱層析，以甲醇-水(5∶5 → 10∶0)梯度洗脫，在 8∶2 洗脫部分析出結晶，用甲醇多次洗滌結晶，石油醚-丙酮重結晶得化合物2(19 mg)；fr.26，即石油醚-乙酸乙酯(15∶1 ～ 12∶1部分(363 mg)經硅膠柱層析分離，用石油醚-丙酮(30∶1→1∶1)梯度洗脫得到 12 個流份，其中fr.5 ～ 6經Sephadex LH-20柱層析，甲醇洗脫分離純化得到化合物 3(26.7 mg)；fr.30，即石油醚-乙酸乙酯10∶1～9∶1部分(163 mg)經硅膠柱層析，用氯仿-丙酮(40∶1→1∶1)洗脫，并經石油醚-丙酮重結晶得到化合物 4(25.2 mg)

2.1.3 化合物的結構鑒定 化合物 1 白色結晶(丙酮)，mp 170～172 ℃，分子式為C30H48O; ESI-MSm/z447 [M + 23]+;1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) 、13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) 數據與文獻[14]對照基本一致，故鑒定化合物 1 為羽扇豆酮。

化合物 2 白色針晶(石油醚-丙酮)；EI-MSm/z488 [M]+,1H-NMR (CDCl3,500 MHz)、13C-NMR (CDCl3, 125 MHz)數據與文獻[15]報道基本一致，故鑒定該化合物2為3β-乙?；R墩果酸。

化合物 3 白色針狀結晶(石油醚-醋酸乙酯), mp 210 ～ 212 ℃,分子式為C30H50O, TLC檢識遇硫酸-甲醇溶液加熱顯紫紅色, Lieberman-Burchard反應為陽性。EI-MSm/z426 [M]+，1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) 、13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)數據與文獻[16]對照基本一致，故鑒定化合物 3 為羽扇豆醇。

化合物 4 白色簇晶(石油醚-丙酮)；EI-MSm/z456 [M]+,1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) 、13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)數據與文獻[17]報道基本一致，故鑒定該化合物4為齊墩果酸。

2.2 羽扇豆醇與羽扇豆酮的含量測定

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應性 色譜柱為Ocean C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流動相：100%甲醇；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；紫外檢測波長：210 nm；進樣量為20 μL。對照品與樣品中的羽扇豆醇和羽扇豆酮色譜峰相互分離度大于1.5，理論塔板數大于5000，對照品和鈍藥野木瓜樣品的HPLC色譜見圖 1。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取羽扇豆醇對照品12.930 mg和羽扇豆酮對照品23.625 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，制成濃度分別為0.5172 mg/mL和0.945 mg/mL對照品貯備液。分別精密吸取上述對照品貯備液適量，加甲醇溶解并稀釋，搖勻，制成羽扇豆醇和羽扇豆酮質量濃度分別為0.0517 mg/mL和0.0945 mg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 取鈍藥野木瓜干燥帶葉莖枝藥材粉末(貴州都勻，過4號篩，50℃烘干)約1.0 g，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，用移液管精密加入甲醇25 mL，密塞，搖勻，稱重，超聲提取30 min，待冷卻后，稱重，用甲醇補足減量，經4000 r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.4 標準曲線的考察 分別精密吸取上述兩種對照品貯備液1、5、10、15、20、25 μL，按2.2.1項下色譜條件分別進樣，記錄色譜圖，以進樣量(X，μg)為橫坐標，峰面積積分值(Y)為縱坐標進行回歸，得羽扇豆醇回歸方程為Y=20.026X-6.1885(r=0.9995，n=6)，進樣量在0.5172～12.93 μg范圍內線性關系良好；回歸方程為羽扇豆酮Y=7.6074X+2.6331(r=0.9992，n=6)，進樣量在0.945～23.625 μg范圍內線性關系良好。見圖2～3。

2.2.5 精密度試驗 分別精密吸取2.2.2項下對照品混合溶液20 μL，按2.2.1色譜條件各連續(xù)進樣6次，測定峰面積，計算RSD分別為0.9%和0.3%，表明儀器的精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 精密稱取同一批鈍藥野木瓜粉末(貴州都勻，過4號篩)6份，每份1.0 g，按供試品溶液的制備方法制備溶液，取供試品溶液20 μL進樣，在上述色譜條件下進行分析，根據峰面積代入回歸方程計算質量，得羽扇豆醇和羽扇豆酮RSD分別為1.2%(n=6)和0.8%(n=6)。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 精密稱取鈍藥野木瓜粉末(貴州都勻，過4號篩)約1.0 g，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，室溫下放置，取供試品溶液20μL，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進樣分析，分別測定峰面積。結果羽扇豆醇和羽扇豆酮峰面積的RSD分別為2.0%和1.5%。表明12 h內供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取鈍藥野木瓜粉末(貴州都勻，過4號篩)約0.5 g，各加入對照品適量，按2.2.3項下方法制備樣品溶液，分別吸取20 μL進樣分析，測定羽扇豆醇、羽扇豆酮的含量，計算加樣回收率。見表1。

表1 鈍藥野木瓜加樣回收率結果

2.2.9 樣品分析 取貴州省3個地區(qū)鈍藥野木瓜的莖和全株，8個地區(qū)鈍藥野木瓜的全株，打成粉末(過4號篩)精密稱定1.0 g，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣，記錄峰面積，外標一點法計算藥材中羽扇豆醇和羽扇豆酮的含量。實驗結果見表2～3。

表2 鈍藥野木瓜藥材不同采收部位兩種三萜含量檢測結果 (n=3)

表3 貴州8個地區(qū)鈍藥野木瓜藥材中兩種三萜含量檢測結果 (n=10)

3 討論

3.1 實驗條件的優(yōu)化 實驗考察了甲醇-水、乙腈-水3個不同比例為檢測體系，結果發(fā)現目標峰出峰較晚，甚至不出峰，而甲醇-水(98∶2)首個目標峰出峰時間接近1 h，用乙腈替換也沒明顯改善出峰時間，而用純甲醇作為流動相時，兩個目標峰羽扇豆醇、羽扇豆酮的出峰時間明顯縮短且分離效果好，故選擇了純甲醇作為流動相。

3.2 樣品處理方法的選擇 實驗考察了不同溶劑(甲醇、乙醇、氯仿及氯仿-甲醇)作為提取溶劑，結果發(fā)現甲醇作為提取溶劑提取率相對較高，氯仿-甲醇(1∶1)及氯仿次之，乙醇作為提取溶劑時目標峰分離效果不好，故選用甲醇作為提取溶劑，同時本實驗也考察了不同濃度甲醇(100%、90%、80%、75%、65%)，不同提取方法(超聲提取法、回流提取法、冷浸提取法)，不同提取時間(0 min、30 min、40 min、50 min、60 min)，不同料液比(15倍、25倍、35倍、45倍體積)，最終確定以100%甲醇為提取溶劑，超聲提取30 min，料液比為25倍時樣品提取率相對較高且操作簡便，故為最優(yōu)處理方法。

3.3 樣品含量測定 由表2可知，鈍藥野木瓜全株植物中的羽扇豆醇含量均高于純莖部位，可能該植物的葉子含有較大量的羽扇豆醇成分，而羽扇豆酮的含量受植株部位的影響較小；由表3中結果顯示，羽扇豆醇的含量受植物生長環(huán)境的影響較小，但不同產地還是存在差異，貴州丹寨地區(qū)的鈍藥野木瓜中羽扇豆醇含量最高，為0.0113 mg/g；羽扇豆酮的含量差異較大，植株受生長環(huán)境因素影響較大，并且貴州貴定地區(qū)的鈍藥野木瓜中羽扇豆酮與總三萜的含量最高，分別為0.0708 mg/g和0.0794 mg/g。貴州省8個不同產地、10批次的藥材中，丹寨和貴定地區(qū)樣品的羽扇豆醇和羽扇豆酮含量最高，分別為0.0113 mg·g-1和0.0708 mg·g-1。

實驗首次從鈍藥野木瓜中分離、純化和鑒定出4種五環(huán)三萜化合物，并建立HPLC法同時測定鈍藥野木瓜藥材中羽扇豆醇和羽扇豆酮的含量，分析方法簡單、可行，研究結果為鈍藥野木瓜藥材的開發(fā)利用提供科學依據。

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