多孔羥基磷灰石椎間融合器制備工藝研究

王 哲，劉 磊，敖 俊，廖文波，趙彥禹，李學(xué)英，吳明松,3，張志敏

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 脊柱外科，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院 貴州省高等學(xué)校口腔疾病研究特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099)

脊椎融合術(shù)是一種可以有效恢復(fù)脊柱穩(wěn)定性、保護(hù)神經(jīng)功能的治療方式。椎間融合是在椎體間隙切除椎間盤結(jié)構(gòu)，刮除上下軟骨終板，在兩椎體間植入各種融合材料，不但可減少內(nèi)固定螺釘松動(dòng)、折斷、拔出等并發(fā)癥，同時(shí)能加速和提高椎體間融合率和融合質(zhì)量[1-2]。尋求一種理想的椎間融合器材料是近年來脊柱融合的研究熱點(diǎn)，目前臨床上常用的椎間融合器多為金屬[3]、可吸收的外消旋聚乳酸(Poly-DL-lactic Acid，PDLLA)[4]、聚醚醚酮[Poly(ether-ether-ketone)，PEEK][5]等材料，然而，這類材料易出現(xiàn)諸如應(yīng)力遮蔽效應(yīng)、降解產(chǎn)物有害、不能與周圍骨組織實(shí)現(xiàn)真正的融合進(jìn)而影響椎間的力學(xué)穩(wěn)定性等問題[6-8]。

羥基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)是自然骨的主要基質(zhì)組成，是骨組織中的主要無機(jī)礦物，具有優(yōu)良的生物相容性、生物活性以及較高的彈性模量，目前HA陶瓷在骨科、牙科臨床修復(fù)中廣泛使用，是一種優(yōu)異的骨組織修復(fù)材料[9-12]。理想的椎間融合器材料需要能夠在有效的時(shí)間內(nèi)達(dá)到真正融合，且植入體內(nèi)后無毒副作用及誘發(fā)組織癌變，而目前HA用于椎間融合器制備仍存在脆性較大、力學(xué)強(qiáng)度較差，體內(nèi)降解時(shí)間較長(zhǎng)等缺點(diǎn)。因此，本研究以羥基磷灰石為原料，探索HA制備椎間融合器的制備工藝，并通過調(diào)節(jié)工藝參數(shù)尋找其孔隙率及力學(xué)強(qiáng)度的平衡點(diǎn)，使制得融合器具有與人體松質(zhì)骨近似的三維連通孔隙結(jié)構(gòu)，并具備合適的力學(xué)強(qiáng)度及較高的成骨性能，為HA的臨床應(yīng)用補(bǔ)充有效數(shù)據(jù)及提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料和試劑 聚乙二醇6000(Polyethylene Glycol 6000，PEG6000)、甲基纖維素(Pethylcellulose，MC)、30%雙氧水和無水乙醇等均購于四川成都市科龍化工試劑廠，羥基磷灰石粉體購于四川大學(xué)生物材料中心(生產(chǎn)批號(hào)：01151101)。所有試劑和原料在使用之前均未作其它改變。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 馬弗爐(上海一恒SX2-4-13)，萬能材料試驗(yàn)機(jī)(日本島津公司AGS-X)，掃描電子顯微鏡(日本日立公司S-4800)，精密電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司BSA-124S)，超聲清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司SG3300HPT)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司GZX-9076MBE)，小型臺(tái)磨機(jī)(浙江永康市蒂凡工具有限公司MOD-DF-4)。

1.3 方法

1.3.1 試劑配置 分別準(zhǔn)確稱量5 g聚乙二醇和1 g甲基纖維素于不同玻璃燒杯中，分別加入100 mL去離子水，并充分?jǐn)嚢柚敝寥芤和耆吻搴蟮玫劫|(zhì)量體積濃度為5%的PEG水溶液和質(zhì)量體積濃度為1%的MC水溶液；均靜置保存在室溫下備用。

1.3.2 漿料的制備 準(zhǔn)確稱量5份25 g羥基磷灰石粉體于5個(gè)100 mL玻璃燒杯中，每個(gè)燒杯中依次加入5%PEG溶液7 mL、1%MC溶液10 mL和去離子水10 mL，用攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆蚝螅糜诔暻逑雌髦谐?5 min，隨后加入體積分?jǐn)?shù)為30%的雙氧水并充分?jǐn)嚢璧玫搅u基磷灰石漿料，以不同的雙氧水加入量1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、10 mL，分別將后續(xù)得到的樣品命名為S1、S3、S5、S7、S10。

1.3.3 坯體成型 采用微波輔助雙氧水發(fā)泡法，將混合均勻的HA漿料放入微波爐中加熱，使雙氧水分解產(chǎn)生氣泡，膨脹后的漿料倒入自制透氣性良好的圓筒形模具中(φ=15 mm×10 mm)，置于鼓風(fēng)干燥箱中在45 ℃下烘干12 h，脫模后得到陶瓷素坯。

1.3.4 燒結(jié)切割 將烘干后的素坯置于馬弗爐中燒結(jié)成瓷，燒結(jié)溫度制度為：室溫～300 ℃，60 min；300 ℃保溫120 min；300～1 150 ℃，160 min；1 150 ℃保溫120 min；1 150 ℃～室溫，隨爐冷卻。將燒結(jié)后的羥基磷灰石陶瓷塊用小型臺(tái)磨機(jī)切割加工，然后打磨成同一規(guī)格尺寸的樣品，再經(jīng)超聲清洗后烘干待用。

1.3.5 表征測(cè)試 利用阿基米德排水法測(cè)量樣品孔隙率[13]。將樣品上下兩面用小型臺(tái)磨機(jī)磨平，準(zhǔn)確測(cè)量樣品尺寸后采用萬能材料試驗(yàn)機(jī)測(cè)試材料的抗壓強(qiáng)度，傳感器載荷為2 000 N，加載速度為1 mm/min，每種試樣均測(cè)7個(gè)平行樣品。樣品宏觀孔隙結(jié)構(gòu)用番紅溶液上色后進(jìn)行觀察，進(jìn)一步使用掃描電鏡(SEM)來表征樣品的孔結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 樣品形貌 燒結(jié)后的多孔羥基磷灰石陶瓷樣品呈圓柱形，與素坯相比收縮率為20%～30%，屬正常范圍。樣品浸潤(rùn)番紅溶液后肉眼明顯可見其表面孔隙結(jié)構(gòu)，如圖1所示，S1樣品的孔較為致密，孔隙較小，材料表面觀察不到較大孔隙；隨雙氧水加入量增多，樣品孔隙越豐富，孔隙結(jié)構(gòu)也變得疏松，S3、S5、S7表面已出現(xiàn)較大孔隙，S10表面有豐富的連通孔隙。圖2為按照臨床現(xiàn)有醫(yī)用椎間融合器尺寸進(jìn)行切割打磨后得到的椎間融合器模型，模型設(shè)計(jì)為類長(zhǎng)方體型塊體，模型長(zhǎng)×寬：10 mm×8 mm，上下表面平行，模型厚度為8 mm。

圖1 制備的多孔羥基磷灰石陶瓷樣品

圖2 制備的多孔HA椎間融合器樣品(A：前視圖；B：俯視圖)

2.2 孔隙率及抗壓強(qiáng)度 由圖3可知，S1、S3、S5、S7、S10孔隙率分別為(24.6±5.7)%、(22.4±0.7)%、(57.7±4.0)%、(54.2±3.3)%、(78.4±2.3)%，對(duì)應(yīng)樣品的抗壓強(qiáng)度分別為(13.8±3.4) MPa、(10.2±0.8) MPa、(7.3±1.0) MPa、(5.1±1.2) MPa、(0.6±0.1) MPa。隨著樣品的孔隙率降低，其對(duì)應(yīng)的抗壓強(qiáng)度逐漸提高，當(dāng)孔隙率降低到25%左右時(shí)，樣品的抗壓強(qiáng)度為最大值13.8 MPa，樣品孔隙率與其抗壓強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)。為了驗(yàn)證該結(jié)果，我們對(duì)樣品的孔隙率與抗壓強(qiáng)度做了相關(guān)性分析，r值為-0.84，兩者呈負(fù)相關(guān)且相關(guān)度較高。

* P < 0.05。圖3 多孔HA陶瓷樣品不同組間孔隙率(A)和抗壓強(qiáng)度(B)的變化

由圖4可知，樣品組S1、S3、S5、S7的斷裂方式均為剛性斷裂，有明顯斷裂點(diǎn)，隨后材料被破壞；各組平行樣中最大載荷可達(dá)約1 500 N，對(duì)應(yīng)的抗壓強(qiáng)度為17.6 MPa。隨樣品孔隙率的增加，抗壓強(qiáng)度逐漸降低，其能承受的最大載荷也逐漸降低，對(duì)于孔隙率最高的S10樣品，其斷裂曲線中并無明顯斷裂點(diǎn)，最大載荷僅約為50 N，強(qiáng)度遠(yuǎn)低于其他各組。

2.3 孔隙結(jié)構(gòu) 圖5為S7組樣品的SEM照片，電鏡下放大100倍后可以看到，樣品內(nèi)都有非常多的球形孔隙，孔隙大小不一，尺寸分布在100～500 μm，隨機(jī)選取部分區(qū)域(圖5A中白色方框范圍)進(jìn)一步放大至200倍，可以看到球形大孔的孔壁上有豐富的貫通孔(圖5B中箭頭所示)，其尺寸分布在20～50 μm。

* P < 0.05。圖4 不同多孔羥基磷灰石陶瓷樣品的載荷-位移圖

A：孔隙結(jié)構(gòu)；B：貫通孔。圖5 多孔羥基磷灰石陶瓷的SEM照片

3 討論

可用于制備椎間融合器的材料應(yīng)主要具有以下幾方面的性質(zhì)[9]：①為術(shù)后的缺損充當(dāng)暫時(shí)性充填和支持功能。為此，材料應(yīng)具有基本的填充功能和足夠的力學(xué)強(qiáng)度。②引導(dǎo)宿主組織長(zhǎng)入缺損部位，形成修復(fù)體與宿主組織間的牢固結(jié)合，使修復(fù)體能更好地行使修復(fù)作用和融合功能。為此，融合器的結(jié)構(gòu)應(yīng)考慮設(shè)計(jì)為多孔結(jié)構(gòu)[14-15]。③誘導(dǎo)新生骨組織形成，實(shí)現(xiàn)損傷缺損部位的骨組織再生。因此，理想椎間融合器材料的選擇，首先需具備良好的生物相容性及較高生物活性，無毒副作用及誘發(fā)組織癌變；其次應(yīng)具有較強(qiáng)的成骨能力，能在有效的時(shí)間內(nèi)完成新骨生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)真正的椎間融合；另外，融合器一般用于承重部位，因此需具備一定的抗壓強(qiáng)度，避免椎弓根釘棒系統(tǒng)發(fā)生斷釘?shù)刃g(shù)后并發(fā)癥。

近10年來，隨著生物材料的飛速發(fā)展，部分生物活性材料諸如納米羥基磷灰石-聚酰胺66(nHA/PA66)復(fù)合材料已經(jīng)用于設(shè)計(jì)制備椎間融合器并應(yīng)用于臨床[11,16-19]，但其自身的材料學(xué)因素限制了其臨床應(yīng)用范圍，一方面，此類融合器的生物活性還有待提高；另一方面，降解產(chǎn)物可能對(duì)組織愈合產(chǎn)生不利影響。因此本研究選擇HA陶瓷材料來制備椎間融合器。對(duì)于多孔HA陶瓷的制備，關(guān)鍵在于成型，目前的成型方法主要有添加造孔劑法、有機(jī)泡沫浸漬法、3D打印、氣體發(fā)泡法等。其中添加造孔劑法可能會(huì)引入雜質(zhì)成分，進(jìn)一步帶來生物毒副作用等問題；有機(jī)泡沫浸漬法制備的多孔材料力學(xué)強(qiáng)度較差，遠(yuǎn)不能滿足承力部位所需。因此，本研究使用了工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，成本低廉，且可以制備出大量?jī)?nèi)部貫通孔結(jié)構(gòu)的氣體發(fā)泡法制備工藝制孔，并希望通過調(diào)節(jié)陶瓷成型時(shí)加入雙氧水的量來調(diào)節(jié)分解氣體的量，從而調(diào)節(jié)孔隙率。

從結(jié)果可以看到，隨著材料孔隙率的降低其抗壓強(qiáng)度會(huì)顯著提升：當(dāng)多孔HA陶瓷樣品孔隙率達(dá)(78.4±2.3)%時(shí)，其抗壓強(qiáng)度僅為0.6±0.1 MPa；而孔隙率降至(24.6±5.7)%后，樣品抗壓強(qiáng)度則升至13.8±3.4 MPa，是高孔隙率樣品的23倍，充分表明了通過調(diào)節(jié)孔隙率來調(diào)節(jié)樣品的抗壓強(qiáng)度是行之有效的方法。此外，從圖4中可以看出，前4組(S1-S7)材料在被破壞時(shí)均為剛性斷裂，表明其力學(xué)性能已適用于椎間融合術(shù)中作為植入材料，對(duì)于S10組，其強(qiáng)度太低，較小的載荷即可對(duì)其造成破壞，不滿足本研究所需。另外，對(duì)于植入材料的高生物活性，除材料本身化學(xué)成份外還需要有大小孔均勻分布、大孔套小孔且孔間貫通的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)更易于骨組織長(zhǎng)入，一定條件下甚至能夠誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[9,20-22]。從圖5中可以看到，本研究所制備的多孔HA陶瓷即具有這種大孔套小孔，孔間貫通的結(jié)構(gòu)。研究指出，當(dāng)植入樣品的孔隙率大于30%時(shí)，才可有效促進(jìn)骨長(zhǎng)入，對(duì)比我們所制備的樣品，樣品S5、S7、S10組滿足該條件。而對(duì)于抗壓強(qiáng)度值來說，黃建松等[23]通過體外實(shí)驗(yàn)研究表明，健康成人在靜態(tài)載荷作用下，胸椎(T1～T12)上的抗壓強(qiáng)度平均值大約為6.37 MPa，腰椎(L1～L5)上的抗壓強(qiáng)度平均值大約為6.14 MPa，對(duì)于此抗壓強(qiáng)度值的要求，樣品組S1、S3、S5滿足條件。

綜上所述，本研究認(rèn)為，S5組多孔HA陶瓷材料初步滿足了作為承力部位植入物對(duì)于孔隙率及抗壓強(qiáng)度的要求。因此在本文所述的這一成型工藝條件下，所制得的多孔HA陶瓷同時(shí)具有合適的孔隙率及抗壓強(qiáng)度，有望進(jìn)一步用于設(shè)計(jì)加工制備椎間融合器。

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