α,α′-雙(對二甲氨亞芐基)環(huán)烷酮的合成及其體外光動力抗腫瘤活性

屈小芳，曹亞萍，吳 慶，胡慶紅，袁澤利

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院無機化學(xué)教研室， 貴州 遵義 563099)

癌癥是嚴(yán)重威脅人類生命和社會發(fā)展的重大疾病[1]，在我國腫瘤死亡占全部死因的1/4，位居疾病死亡第一位[2]。目前臨床上治療癌癥的手段主要有化學(xué)治療、放射治療、手術(shù)治療、光動力治療等。光動力治療(Photodynamic Therapy，PDT)因其屬于非入侵性的治療方法，有著創(chuàng)傷小、不良反應(yīng)少、低積累毒性等優(yōu)勢[3]，在治療癌癥等惡性疾病以及多種良性疾病等方面表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。

PDT涉及光敏劑、光和氧分子[4]的參與。先經(jīng)系統(tǒng)或局部給予光敏劑，當(dāng)光敏劑隨血液循環(huán)到達(dá)病變部位后，利用特定波長激光照射病變部位，使其產(chǎn)生大量的單線態(tài)氧(1O2)物種，從而清除病變組織[5-6]。已應(yīng)用于臨床的光敏劑如卟啉、酞箐等具有吸收波長處于近紅外區(qū)(600～800 nm)的組織穿透性強、產(chǎn)生單線態(tài)氧量多等優(yōu)勢[7-8]。然而，這些光敏劑多為混合物(不同異構(gòu)體混合)，且制備成本高等問題。因而，探尋制備簡單、成分單一的處于近紅外區(qū)的新光敏劑成為研究者們熱衷的方向。

α,α′-雙(對二甲氨亞芐基)環(huán)烷酮類化合物是重要的有機合成中間體，其共軛的π體系，使其結(jié)構(gòu)在光學(xué)性能上具有雙光子吸收性能，波長接近紅光區(qū)而常被作為光學(xué)材料。此外，該基團也在醫(yī)藥、農(nóng)藥等方面被應(yīng)用[9-11]，如在抗HIV-1、抗腫瘤等藥理活性[12-13]中被作為藥學(xué)團進(jìn)行藥物設(shè)計。如Zou等[14]最近研究表明α,α′-雙(對二甲氨亞芐基)結(jié)構(gòu)還具有光輻射產(chǎn)生單線態(tài)氧而殺傷腫瘤的活性，這為該結(jié)構(gòu)在醫(yī)藥方面應(yīng)用奠定了新的基礎(chǔ)，但Zou等[14]未基于母核環(huán)進(jìn)行系統(tǒng)擴充及甲基斥電子基團進(jìn)行研究。為探尋中間母核環(huán)烷酮環(huán)對光敏劑光動力抗腫瘤活性，本研究構(gòu)建了3個不同環(huán)烷酮母核的α,α，-雙(亞芐基)環(huán)烷酮先導(dǎo)化合物，其合成路線如圖1所示。

圖1 目標(biāo)化合物1的合成

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Varian 1 000 FT-IR紅外光譜儀(4 000～400 cm-1，KBr壓片，美國Varian公司)，Micromass LCT Premier XE高分辨質(zhì)譜儀(德國Bruker公司)；Bruker APEX2 Smart CCD型單晶X射線衍射儀(德國Bruker公司)；TU-1901紫外-可見分光光度計(北京譜析儀器公司)；Vary Eclipse熒光分光光度計(美國Varian公司)；安捷倫400 MHz-DD2磁共振儀(美國安捷倫公司)；DHJF-4002低溫恒溫攪拌反應(yīng)浴(鄭州長城科工有限公司)；CKX41倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；QB-9001微孔板快速震蕩器(上海瀘粵明科學(xué)儀器有限公司)；Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀(美國Thermo 公司)。

對二甲氨基苯甲醛(上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司)；環(huán)丁酮[韶遠(yuǎn)科技(上海)有限公司]；環(huán)戊酮(化學(xué)純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；環(huán)己酮[薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司]。未經(jīng)特別說明所用溶劑均為分析純。

1.2 目標(biāo)化合物1的合成 以化合物1a的合成為例：將0.532 g(7.59 mmol)環(huán)丁酮和0.2 g的氫氧化鈉溶于50 mL乙醇和5 mL純化水溶液中，將其置于低溫攪拌反應(yīng)儀并于-10 ℃下攪拌約5 min，再緩緩加入2.238 g(15 mmol) 的對二甲氨基苯甲醛，繼續(xù)反應(yīng)6 h，抽濾，甲醇洗滌，得到黃色固體。用乙醇和二氯甲烷或乙醇重結(jié)晶得紅色塊狀晶體1a，產(chǎn)率65%。 m.p.252.0～252.4 ℃。1H NMR(CDCl3,400 MHz),δ(ppm):7.46～7.48(d,4H,J=8.9 Hz,Ar-H),7.14(s,2H,Ar-CH=C),6.69～6.72(d,4H,J=8.8 Hz,Ar-H),3.72(s,2H,-CH2-),3.04(s,12H,-CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz),δ(ppm):151.23,144.75,141.49,131.51,127.00,123.00,111.96,40.12,35.11; HRMS(ESI-MS),理論計算值C22H24N2O:333.1967(M+H+),實測值：333.203 8; FT-IR(4 000～400 cm-1,KBr壓片):3 448.04,2 916.52,2 852.01,2 803.00,1 696.71,1 648.00,1 588.73,1 525.29,1 479.19,1 365.47,1 311.16,1 236.04,1 169.11,1 133.64,1 091.14,945.25,809.53。按類似方法合成得到1b和1c。

1b:紅色針狀晶體，產(chǎn)率90%。m.p.300.1～301.4 ℃.1H NMR (CDCl3,400 MHz),δ(ppm):7.53-7.54(d,4H,J=8.0 Hz,Ar-H),7.26(s, 2H, Ar-CH=C)，6.72～6.74(d,4H,J=8.7 Hz,Ar-H),4.08(s,4H,-CH2-),3.04(s,12H,-CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz),δ(ppm):150.71,133.55,133.48,132.54,124.23,111.87,40.13,26.64; HRMS(ESI-MS),理論計算值 C23H26N2ONa:369.194 3(M+Na+),實測值：369.192 3; FT-IR(4 000～400 cm-1,KBr壓片):3 445.36,3 095.26,2 969.70,2 929.37,1 649.92,1 649.92,1 582.48,1 517.89,1 404.26,1 357.27,1 273.00,1 196.57,1 153.71,1 127.56,1 074.63,1 013.59,969.95,818.05,730.60,517.16。

1c:紅色粉末，產(chǎn)率53%。m.p.65.4～66.5 ℃.1H NMR (CDCl3,400 MHz),δ(ppm):7.43～7.45(d,4H,J=8.9 Hz,Ar-H),7.76(s,2H,Ar-CH=C),6.70～6.72(d,4H,J=8.9Hz,Ar-H),3.01(s,12H,-CH3),2.92～2.94(t,4H,J=4.1Hz,-CH2-),1.77～1.82(m,2H,-CH2-);13C NMR (CDCl3,100 MHz),δ(ppm):186.10,146.37,133.05,128.45,120.30,107.67,107.28,36.20,24.78,19.24; HRMS(ESI-MS),理論計算值 C24H28N2O:383.209 9(M+Na+),實測值：383.207 8; FT-IR (4 000～400 cm-1,KBr壓片):3 786.98,3 430.66,2 921.30,1 702.68,1 606.47,1 526.18,1 444.36,1 370.02,1 276.88,1 182.04,1 231.74,1 104.18,946.59,825.86,768.56,699.110,619.03,530.82。

1.3 單晶結(jié)構(gòu)測定和解析 將1a固體用乙醇加熱溶解后，室溫條件下緩慢揮發(fā)溶劑，2 d后得到適宜單晶測試的1a。用Bruker APEX2 Smart CCD單晶衍射儀收集數(shù)據(jù)，采用經(jīng)石墨單色器單色化的Mo Kα射線(λ=0.071 073 nm)，以φ-ω掃描方式收集單晶衍射數(shù)據(jù)。得到的強度數(shù)據(jù)進(jìn)行經(jīng)驗吸收校正、LP 校正后，采用直接法解得晶體結(jié)構(gòu)，最后用全矩陣最小二乘法修正了全部非氫原子坐標(biāo)及其各向異性熱參數(shù)。用SHELX-97程序完成所有計算[15]。

1.4 光學(xué)性質(zhì)測定 將化合物1a～1c用無水乙醇配成濃度為2.24×10-4mol/L，作為儲備液，然后各取0.1 mL稀釋至10 mL，使其濃度為2.24×10-6mol/L，使用TU-1901紫外-可見分光光度計和Carry熒光分光光度計分別測其紫外-可見吸收光譜和熒光光譜(狹縫寬度均為5 nm，電壓為中等)。所得數(shù)據(jù)用origin 8軟件進(jìn)行處理繪制。

1.5 體外抗腫瘤活性考察 采用MTT法考察化合物1a～1c對 A549(人源肺腺癌細(xì)胞)和 HepG2(人源肝癌細(xì)胞，2個細(xì)胞均來源于遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究中心)的生長抑制活性。具體步驟如下：取處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，接種于96孔板中(2.0×104～5×104個/mL)，放置5% CO2、飽和濕度及37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h后[16]，加入5、10、20、40、60、80、100和120 μmol/L的受試化合物，暗室孵育20 h，用光功率為7 mW·cm-2溴鎢燈光照15 min，再暗室37 ℃孵育4 h,然后每孔加入10 μL (5 mg/mL)的MTT溶液和90 μL培養(yǎng)基，暗室37 ℃孵育 4 h，將孔內(nèi)液體吸棄，每孔加入100 μL DMSO，室溫下振搖5 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀測490 nm OD值。細(xì)胞增殖抑制率公式為：抑制率=1-[OD(樣品)-OD(空白)]/[(OD細(xì)胞對照-OD空白)]×100%。暗毒性考察不需燈照，其他條件同上。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)表征 以1a的1H NMR為例，在目標(biāo)化合物的1H NMR中，在δ7.46～7.48 ppm處的雙峰為對稱芳環(huán)上的4個芳環(huán)質(zhì)子化學(xué)位移；在δ7.14 ppm處的單峰為新生成的兩個烯鍵質(zhì)子化學(xué)位移；而在δ6.69～6.72 ppm處的雙峰為對稱芳香環(huán)上的4個質(zhì)子化學(xué)位移。此外在δ3.72 ppm處的單峰為環(huán)丁酮結(jié)構(gòu)中的亞甲基的2個質(zhì)子化學(xué)位移，而在δ 3.04 ppm的單峰為氨基位取代的12個甲基質(zhì)子化學(xué)位移。1b、1c的1H NMR測試結(jié)果與之類似，不同之處在于1b在δ 4.08 ppm處出現(xiàn)了4個環(huán)戊酮亞甲基質(zhì)子化學(xué)位移；而1c卻在δ 2.94～1.77 ppm處出現(xiàn)了2組6個亞甲基質(zhì)子化學(xué)位移。而在1a的13C NMR譜中，在δ 150～180 ppm處出現(xiàn)了環(huán)酮碳基碳信號，在δ 107～144 ppm處為芳環(huán)碳和生成的C=C雙鍵碳信號；而19～40 ppm處為亞甲基和甲基碳信號。在1a～1c的HRMS譜圖中測定值與理論計算值均在5‰范圍內(nèi)。p在1a～1c的FT-IR譜中，于1 969～1 702 cm-1出現(xiàn)了?C=O特征振動吸收峰，在2 852～2 969 cm-1處出現(xiàn)了甲基和亞甲基的特征振動吸收峰。

上述譜圖表征充分證實，得到的化合物為預(yù)期結(jié)構(gòu)。

2.2 單晶結(jié)構(gòu) 單晶X射線衍射測試表明，化合物1a的晶體結(jié)構(gòu)屬于單斜晶系(Monoclinic)，P21/c空間群，分子式為C22H24N2O，晶胞參數(shù)為a=7.489(2) ?,b=19.945(6) ?,c=12.403(3) ?,α= 900,β= 96.9650(10),γ= 900,V=1 839.0(9) ?3,Dc=1.201 Mg/m3,μ=0.074 mm-1,Z=4,F(000)=712.0,R1=0.065 5,wR2=0.224 0,s=0.902。晶體數(shù)據(jù)存于英國劍橋數(shù)據(jù)中心，CCDC 號為1586168。

1a的分子結(jié)構(gòu)見圖2，鍵長、鍵角見表1。由圖2可以看出，此分子結(jié)構(gòu)中含有2個N,N-二甲基芳香環(huán)單元和1個環(huán)丁酮單元，芳香環(huán)與環(huán)丁酮通過環(huán)外雙鍵相連。表1的晶體數(shù)據(jù)表明：環(huán)丁酮的C-C鍵長處于1.47 ?～1.53 ?之間，C=O鍵長為1.218 ?。環(huán)丁酮和芳環(huán)之間的雙鍵的C=C鍵為1.33 ?，而苯環(huán)上C=C鍵處于1.37 ?～1.41?間，C-N鍵長在1.42 ?～1.46 ?之間，這些鍵長與文獻(xiàn)報道的鍵長相吻合[17-18]。同時，環(huán)丁酮的鍵角在90.7o～91.4°，基本上接近90°，鍵角趨于平均化，有助于化合物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[17]，且鍵角和為359.96°，4個C原子基本處于同一個平面。

圖2 化合物1a的分子結(jié)構(gòu)

表1化合物1a的選擇性鍵長(?)和鍵角(°)

鍵長 (?)鍵角 (o)C(1)-N(1)1.439(3)C(5)-C(4)-C(3)121.4(2)C(2)-N(1)1.433(4)C(7)-C(6)-C(5)116.2(3)C(3)-N(1)1.375(4)C(7)-C(6)-C(9)123.7(2)C(3)-C(4)1.396(4)C(9)-C(10)-C(11)132.1(2)C(6)-C(7)1.390(3)C(9)-C(10)-C(13)137.1(3)C(10)-C(11)1.478(4)C(11)-C(10)-C(13)90.8(2)C(9)-C(10)1.334(4)O(1)-C(11)-C(10)134.7(3)C(10)-C(13)1.526(3)C(10)-C(11)-C(12)91.1(2)C(11)-O(1)1.221(3)C(11)-C(12)-C(13)90.4(2)C(12)-C(14)1.333(4)N(2)-C(18)-C(17)122.1(3)C(12)-C(13)1.528(4)N(2)-C(18)-C(19)121.9(3)C(18)-N(2)1.364(3)C(3)-N(1)-C(2)121.3(2)C(21)-N(2)1.451(4)C(18)-N(2)-C(22)121.3(3)C(22)-N(2)1.448(4)C(22)-N(2)-C(21)117.1(3)

2.3 化合物1a～1c的吸收光譜和熒光光譜 由圖3A可以看出：化合物1a～1c最大吸收波長分別在470 nm、483 nm和447 nm處,它們的吸光度為1a<1b<1c，尤以環(huán)己酮生成的1c的吸光度為1a和1b的10倍和13倍。而在熒光發(fā)射圖譜中(見圖3B)，熒光發(fā)射峰分別在588 nm、600 nm和567.05 nm處，且熒光強度大小為1a<1c<1b。

圖3 化合物1a～1c的紫外-可見光譜(A)和熒光光譜(B)

2.4 體外光毒性 化合物1a～1c避光和光照對人肺腺癌細(xì)胞(A549)和人源肝癌細(xì)胞(HepG2)受試細(xì)胞株的生長抑制活性結(jié)果(見表2)。由表2可以看出：3個化合物均無暗毒性，在光毒性方面，化合物1b和1c對受試腫瘤細(xì)胞株也無毒性，僅化合物1a對2株受試腫瘤細(xì)胞株表現(xiàn)出較強的光毒性，IC50分別5.48 μmol/L、10.50 μmol/L，表明以環(huán)丁酮為母核的α,α′- 雙(對二甲氨亞芐基)環(huán)烷酮作為新光敏劑設(shè)計值得進(jìn)一步深入研究。

表2化合物1a～1c對兩種受試細(xì)胞的體外抑制活性[IC50/(μmol/L)]

化合物A549暗毒性光毒性HepG2暗毒性光毒性1a>1005.48>10010.501b>100>100>100>1001c>100>100>100>100

3 討論

α,α′- 雙(對二甲氨亞芐基)環(huán)烷酮類化合物合成有微波輻射相轉(zhuǎn)移催化法[19-20]、強酸性陽離子交換樹脂催化法[21]、ZrOCl2·8H2O催化法[9]等。本研究中，通過加入NaOH堿化溶劑來催化芳香醛與環(huán)烷酮進(jìn)行Cross-Aldol縮合反應(yīng)。該方法操作簡便，催化劑價廉易得，反應(yīng)環(huán)境溫和，后處理簡單，對于發(fā)展化學(xué)藥物的低碳綠色技術(shù)具有十分重要的意義。

光動力治療是一種利用光動力效應(yīng)對腫瘤和其他病理性靶組織進(jìn)行診斷和治療的新技術(shù)[22]。當(dāng)藥物達(dá)到病灶組織后，對病灶組織進(jìn)行光定位照射，從而殺傷病灶組織，而不損傷正常組織。因此，理想光敏劑應(yīng)具備暗毒性低、對正常組織毒副作用低，且對病灶部位和靶向組織更具有選擇性等條件?；衔?a在暗室條件下對細(xì)胞的殺傷效應(yīng)低(即無暗毒性)，在光照下對受試腫瘤細(xì)胞株表現(xiàn)出顯著光毒性，表明其具備理想光敏劑的無暗毒性條件，值得進(jìn)一步研究其體內(nèi)活性。

此外，從藥效團結(jié)構(gòu)與光動力毒性方面看，增大母核環(huán)烷酮的環(huán)系未表現(xiàn)出對受試腫瘤細(xì)胞株的光毒性，這可能是由于環(huán)系增加導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)更易于扭曲，致使分子共軛較弱，故以小環(huán)的環(huán)丁酮為母核新光敏劑設(shè)計值得進(jìn)一步開展。

綜上所述，本實驗在NaOH催化下，將對二甲氨基苯甲醛分別與環(huán)烷酮類化合物通過Cross-Aldol縮合生成α,α′-(對甲氨亞芐基)環(huán)烷酮1a～1c，并通過核磁1H NMR、13C NMR譜、FT-IR譜、高分辨質(zhì)譜及單晶XRD等現(xiàn)代分析手段表征為預(yù)期目標(biāo)分子。采用MTT法研究化合物1a～1c避光和光照條件下對人肺腺癌細(xì)胞(A549)和人源肝癌細(xì)胞(HepG2)受試細(xì)胞株的生長抑制活性。結(jié)果表明：化合物1a對A549(人肺腺癌細(xì)胞)和 HepG2(人源肝癌細(xì)胞)均有較強的光毒性，值得進(jìn)一步研究。

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