劃時(shí)代的冷凍電鏡技術(shù)

李忠東

2017年10月4日， 2017年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了英國分子生物學(xué)家及生物物理學(xué)家理查德·亨德森、美國哥倫比亞大學(xué)德裔生物物理學(xué)家約阿基姆·弗蘭克以及瑞士洛桑大學(xué)生物物理學(xué)家雅克·迪波什。獲獎(jiǎng)理由是“開發(fā)出冷凍電子顯微鏡技術(shù)（也稱為低溫電子顯微鏡技術(shù)）用于確定溶液中的生物分子的高分辨率結(jié)構(gòu)”，簡化了生物細(xì)胞的成像過程，提高了成像質(zhì)量。

成績斐然 實(shí)至名歸

亨德森 選擇高分辨率觀察生物大分子

現(xiàn)年72歲的理查德·亨德森出生于蘇格蘭，現(xiàn)為劍橋大學(xué)醫(yī)學(xué)研究理事會(huì)MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室主任，發(fā)起了一場高分辨率觀察生物大分子的革命。1975年，電子顯微鏡誕生40年之際，因亨德森在細(xì)菌視紫紅質(zhì)上的嘗試，證明了電子顯微鏡在生物領(lǐng)域的適用性。他將未脫離細(xì)胞膜的細(xì)菌視紫紅質(zhì)直接放置在電子顯微鏡下進(jìn)行觀察，借助表面覆蓋的葡萄糖防止真空干涸，并采用強(qiáng)度更低的電子束流，觀察到細(xì)菌視紫紅質(zhì)在細(xì)胞膜上規(guī)整排列且朝向一致。

之后，亨德森和同事獲得了細(xì)菌視紫紅質(zhì)較為粗糙的三維立體結(jié)構(gòu)圖像，這也是歷史上第一張膜蛋白領(lǐng)域的三維結(jié)構(gòu)圖像。1990年，亨德森又成功地使用電子顯微鏡顯示蛋白質(zhì)的三維圖像，達(dá)到原子級(jí)分辨率。這一突破性成果證明了用電子顯微鏡進(jìn)行生物分子成像的潛力。

弗蘭克 冷凍電鏡單顆粒分析的鼻祖

現(xiàn)年77歲的德裔生物物理學(xué)家約阿基姆·弗蘭克，最大的貢獻(xiàn)是讓冷凍電鏡技術(shù)變得具有普遍應(yīng)用價(jià)值。弗蘭克在1981年完成了一種算法，利用計(jì)算機(jī)識(shí)別圖像把相同蛋白質(zhì)的不同影子收集起來，并且將輪廓相似的圖像進(jìn)行分類對(duì)比，通過分析不同的重復(fù)模式將圖片擬合成更加清晰的2D圖像。

在此基礎(chǔ)上，通過數(shù)學(xué)方法，在同一種蛋白質(zhì)的不同2D圖像之間建立聯(lián)系，以此為基礎(chǔ)擬合出3D結(jié)構(gòu)圖像，他的圖形擬合程序被認(rèn)為是冷凍電鏡發(fā)展的基礎(chǔ)。此外，他對(duì)細(xì)菌和真核生物的核糖體結(jié)構(gòu)和功能的研究也做出重要貢獻(xiàn)。

迪波什 在真空環(huán)境下使生物分子保持自然形狀

現(xiàn)年75歲的雅克·迪波什出生于瑞士，他的重要貢獻(xiàn)是在真空環(huán)境下使生物分子保持自然形狀。大致于1978年，迪波什開始解決電子顯微鏡領(lǐng)域的樣品干涸并遭破壞的問題。如前所述，亨德森在細(xì)菌視紫紅質(zhì)成像上曾用葡萄糖來保護(hù)樣品，但這種方法并不普遍適用。

迪波什得出的方法是對(duì)生物樣品進(jìn)行玻璃化。一般情況下，通過氫鍵的相互作用，水分子會(huì)在凝固過程中有序排列，形成晶體。而迪波什想到的即是在水分子相互作用之前就讓其凝固，方法是將生物樣品浸入事先經(jīng)液氮冷卻的乙烷中，這樣就能使水在數(shù)毫秒之內(nèi)完全凝固。這種方法得到的就不是晶體而是無定形態(tài)，而玻璃也是處于無定形態(tài)，玻璃化名稱由此而來。生物樣品嵌在無定形冰中，堪稱留下了真實(shí)的一瞬間。1982年，迪波什開發(fā)出真正成熟可用的快速投入冷凍制樣技術(shù)制作的不形成冰晶體的玻璃態(tài)冰包埋樣品。1984年，迪波什首次發(fā)布不同病毒的結(jié)構(gòu)圖像。隨著冷臺(tái)技術(shù)的開發(fā)，冷凍電鏡技術(shù)正式推廣開來。

傳統(tǒng)方法 難以為繼

核酸和蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的關(guān)鍵密碼，核酸攜帶遺傳物質(zhì)，備受科學(xué)家關(guān)注，蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要執(zhí)行者。人們對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析始于20世紀(jì)60年代。結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域有一條不成文的觀點(diǎn)：結(jié)構(gòu)決定功能。只有知道生物分子的原子排布，科學(xué)家們才能了解這個(gè)蛋白的功能。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的常用實(shí)驗(yàn)方法有兩種：X射線衍射晶體學(xué)成像和核磁共振成像。

作為最早用于結(jié)構(gòu)解析的實(shí)驗(yàn)方法之一，X射線衍射晶體學(xué)成像運(yùn)用了幾十年。X射線是一種高能短波長的電磁波（本質(zhì)上屬于光子束），被德國科學(xué)家倫琴發(fā)現(xiàn)，故又被稱為倫琴射線。理論和實(shí)驗(yàn)都證明了，當(dāng)X射線打擊在分子晶體顆粒上的時(shí)候，X射線會(huì)發(fā)生衍射效應(yīng)，通過探測(cè)器收集這些衍射信號(hào)，可以了解晶體中電子密度的分布，再據(jù)此獲得粒子的位置信息。由于X射線對(duì)晶體樣本有著很大的損傷，因此常用低溫液氮環(huán)境來保護(hù)生物大分子晶體，但是這種情況下的晶體周圍環(huán)境非常惡劣，可能會(huì)對(duì)晶體產(chǎn)生不良影響。而且X射線衍射方法不能用來解析較大的蛋白質(zhì)。

核磁共振成像的基本理論是，帶有孤對(duì)電子的原子核（自選量子數(shù)為1）在外界磁場影響下，會(huì)導(dǎo)致原子核的能級(jí)發(fā)生塞曼分裂，吸收并釋放電磁輻射，即產(chǎn)生共振頻譜。這種共振電磁輻射的頻率與所處磁場強(qiáng)度成一定比例。利用這種特性，通過分析特定原子釋放的電磁輻射結(jié)合外加磁場，可以用于生物大分子的成像或者其他領(lǐng)域的成像。核磁共振結(jié)構(gòu)解析多是在溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，一般認(rèn)為比起晶體結(jié)構(gòu)更能夠描述生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)結(jié)構(gòu)，而且能夠獲得氫原子的結(jié)構(gòu)位置。然而核磁共振也并非萬能，有時(shí)候也會(huì)因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在溶液中結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定難以獲取穩(wěn)定的信號(hào)，因此，往往需要借助計(jì)算機(jī)建?；蛘咂渌椒▉硗晟平Y(jié)構(gòu)解析流程。

但事實(shí)上，以上兩種常用的傳統(tǒng)手段都不能讓研究者獲得高分辨率的大型蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)，致使生物結(jié)構(gòu)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展受困于成像技術(shù)。

迅速發(fā)展 大有作為

2013年，冷凍電鏡技術(shù)出現(xiàn)突破：不需要結(jié)晶且需要樣品量極少，即可迅速解析大型蛋白復(fù)合體原子分辨率的三維結(jié)構(gòu)。電子直接探測(cè)相機(jī)和三維重構(gòu)軟件兩項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生重大影響，傳統(tǒng)X射線、傳統(tǒng)晶體學(xué)長期無法解決的許多重要大型復(fù)合體及膜蛋白的原子分辨率結(jié)構(gòu)，一個(gè)個(gè)被迅速解決，并紛紛強(qiáng)勢(shì)占領(lǐng)頂級(jí)期刊和各大媒體版面。研究人員通過對(duì)運(yùn)動(dòng)中的生物分子進(jìn)行冷凍，即可在原子層面上進(jìn)行高分辨成像，無需將大分子樣品制成晶體。隨后這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用也正式迎來井噴式發(fā)展階段。2015年，國際著名期刊《自然》旗下子刊《自然方法》將冷凍電鏡技術(shù)評(píng)為年度最受關(guān)注的技術(shù)。

引領(lǐng)這些技術(shù)突破的背后離不開亨德森、弗蘭克和迪波什三位冷凍電鏡領(lǐng)域的開拓者分別在基本理論、重構(gòu)算法和實(shí)驗(yàn)方面的早期重要貢獻(xiàn)。諾貝爾獎(jiǎng)官方表示：“三人的貢獻(xiàn)令生物分子的成像變得更簡單和清晰，讓生物化學(xué)進(jìn)入了一個(gè)新時(shí)代。我們可能很快就能在原子分辨率上獲得復(fù)雜的生命裝置的精細(xì)圖像。”甚至有媒體稱：“冷凍電鏡是可與測(cè)序技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)相提并論的第三大技術(shù)?！?/p>

冷凍電鏡技術(shù)，指的是應(yīng)用冷凍固定術(shù)，在低溫下使用透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術(shù)，能將生物分子“凍起來”， 讓人們前所未有地觀察分析其運(yùn)動(dòng)過程，對(duì)于生命化學(xué)的理解和藥物學(xué)的發(fā)展都有決定性影響。具體操作時(shí)，先將樣品冷凍起來，然后在低溫狀態(tài)下放進(jìn)顯微鏡，讓高度相干的電子作為光源從上面照下來，透過樣品和附近的冰層，造成散射。再利用探測(cè)器和投射系統(tǒng)把散射信號(hào)成像記錄下來，最后進(jìn)行信號(hào)處理，得到樣品結(jié)構(gòu)。

這項(xiàng)用于掃描電鏡的超低溫冷凍制樣及傳輸技術(shù)可實(shí)現(xiàn)直接觀察液體、半液體及對(duì)電子束敏感的樣品，如生物、高分子材料等。樣品經(jīng)過超低溫冷凍、斷裂、鍍膜制樣（噴金/噴碳）等處理后，通過冷凍傳輸系統(tǒng)放入電鏡內(nèi)的冷臺(tái)（溫度可至-185℃）即可進(jìn)行觀察。其中，快速冷凍技術(shù)可使水在低溫狀態(tài)下呈玻璃態(tài)，減少冰晶的產(chǎn)生，從而不影響樣品本身結(jié)構(gòu)，冷凍傳輸系統(tǒng)保證研究人員在低溫狀態(tài)下對(duì)樣品進(jìn)行電鏡觀察。

將電子顯微鏡和計(jì)算機(jī)建模成像結(jié)合在一起的大量實(shí)踐，是在新世紀(jì)之后開始流行的。冷凍電鏡時(shí)代的真正來臨，還得益于樣品制備技術(shù)、新一代電子探測(cè)器發(fā)明、軟件算法優(yōu)化等多方面技術(shù)的進(jìn)步，更多的信息和更低的噪音保證了高分辨率的圖像。

科學(xué)家希望能制造出更靈敏的電子探測(cè)器，以及更好地制備蛋白樣本的方法。這樣的話，就能夠?qū)Ω〉摹⒏鼊?dòng)態(tài)的分子進(jìn)行成像，并且分辨率更高。在大數(shù)據(jù)時(shí)代的基因組、蛋白質(zhì)組、代謝組、脂類組等飛速發(fā)展的今天，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組理應(yīng)得到更加廣泛的重視，針對(duì)蛋白質(zhì)的藥物篩選和計(jì)算機(jī)輔助的藥物研究不應(yīng)被低估。發(fā)展高精度、高效的結(jié)構(gòu)解析技術(shù)有著重要意義，可以預(yù)見未來在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)領(lǐng)域有著更多的驚喜。