模式識(shí)別受體激活狀態(tài)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞p38-MAPK磷酸化水平的影響

鄭翰軒, 張 郃

首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥劑科, 北京 100053

阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是一種老年神經(jīng)退行性疾病，其病因復(fù)雜，已有的β淀粉樣蛋白毒性學(xué)說認(rèn)為，寡聚形態(tài)的Aβ42(oAβ42)引起的細(xì)胞毒性最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能紊亂，甚至凋亡，是AD發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[1]。在腦內(nèi)Aβ42形成聚集物的早期利用腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用對(duì)其進(jìn)行清除是極具希望的AD療法[2]。小膠質(zhì)細(xì)胞的模式識(shí)別受體(PRR)根據(jù)其功能性質(zhì)可分為兩類：識(shí)別異物的病原感受器受體(TLRs)家族(如TLR2)和清除異物的清道夫受體(scavenger receptors，SRs)家族，如SRA、SRB、CD36受體等；兩類受體分別負(fù)責(zé)機(jī)體內(nèi)異物或病理性蛋白的識(shí)別與清除，并通過交互作用完成固有免疫過程?，F(xiàn)已證實(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞表面特定模式識(shí)別受體參與AD過程中Aβ42蛋白清除的信號(hào)傳遞，該過程中吞噬作用的肌動(dòng)蛋白重組過程需要 p38-MAPK激酶的激活，但清道夫受體如何調(diào)節(jié)其配體作用后的最終反應(yīng)還不清楚。本研究通過測(cè)定小膠質(zhì)細(xì)胞清道夫家族(SRs)受體和toll樣受體2(TLR2)在Aβ42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中對(duì)p38-MAPK磷酸化信號(hào)水平的影響，探討清道夫家族受體和toll樣受體在該吞噬信號(hào)傳遞過程中的作用，以期研究膠質(zhì)細(xì)胞被oAβ42誘導(dǎo)時(shí)，SRA受體和TLR2受體的狀態(tài)對(duì)p38-MAPK磷酸化信號(hào)水平的影響，并進(jìn)一步研究TLR2受體被其抗體中和時(shí)，細(xì)胞對(duì)oAβ42的吞噬量的變化，從而為在分子水平調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞與Aβ42相互作用的受體激活劑、基因封閉劑等AD免疫療法提供參考。

1 材料及方法

1.1 材料

大鼠抗小鼠SRA(AbD Serotec公司)、SRB(Abcam公司)、CD36(Abcam公司)抗體、蛋白磷酸化檢測(cè)試劑盒(Abcam)、受體內(nèi)吞抑制劑 (pitstop，Abcam公司)、oAβ1-42檢測(cè)試劑盒(IBL公司)、BCA 試劑盒(Pierce公司)、Aβ42(American Peptide公司)、抗鼠TLR2-功能性抗體(Invivogen公司)、蛋白酶抑制劑(Calbiochem公司)、DMSO(Sigma公司)、DMEM 培養(yǎng)液(HyClone公司)。

1.2 方法

1.2.1Aβ42寡聚體的制備 制備Aβ42蛋白寡聚體，使分散的Aβ42蛋白單體在低溫條件下緩慢聚集形成刺激性及毒性較強(qiáng)的寡聚形態(tài)Aβ42(oAβ42)，最后14 000 g高速離心去除纖維形態(tài)及高聚集形態(tài)的oAβ42[3]，具體方法為：用1.3 μL DMSO把分裝后30 μg的Aβ42(分子量4 514 g/moL)薄膜重懸為5 mmol/L，水浴超聲10 min，補(bǔ)入65.1 μL細(xì)胞培養(yǎng)基配置成100 μmol/L，在4℃孵育24 h，制得oAβ42母液。Aβ42使用濃度解釋：在上述66.4 μL母液中加入6.6 mL培養(yǎng)基，混勻，制得1 μmol/L的oAβ42實(shí)驗(yàn)液。在66.4 μL母液中加入3.3 mL培養(yǎng)基吹打混勻，制得2 μL的oAβ42實(shí)驗(yàn)液，取44 μL母液,加入956 μL培養(yǎng)基混勻，制得20 μg/mL的oAβ42實(shí)驗(yàn)液。

1.2.2蛋白磷酸化水平的熒光測(cè)定 將狀態(tài)良好的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔約1×104個(gè)細(xì)胞，37℃、5% CO2環(huán)境培養(yǎng)24 h。

膠質(zhì)模式識(shí)別受體的激活：?jiǎn)为?dú)細(xì)胞、細(xì)胞+巖藻糖(100 μg/mL)、細(xì)胞+oAβ42(20 μg/mL)，每組6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)組向細(xì)胞加入巖藻糖(100 μg/mL)，oAβ42(20 μg/mL)孵育1 h，檢測(cè)各組p38-MAPK磷酸化水平。

膠質(zhì)細(xì)胞模式識(shí)別受體的阻斷：?jiǎn)为?dú)細(xì)胞，細(xì)胞+oAβ42，細(xì)胞+各模式識(shí)別受體的功能性抗體(SRA，SRB，CD36，TLR2)+oAβ42，每組6個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組向細(xì)胞加入模式識(shí)別受體SRA、SRB、CD36、TLR2的功能性抗體(10 μg/mL)孵育1 h后，各組細(xì)胞加入2 μmol/L的oAβ42孵育1 h，檢測(cè)p38-MAPK磷酸化水平，具體方法為：配制p38-MAPK磷酸化蛋白的捕獲抗體與檢測(cè)抗體等體積混合物，與各孔的細(xì)胞裂解液共同轉(zhuǎn)移至相應(yīng)磷酸化蛋白檢測(cè)孔板，于室溫300 r/min孵育1 h，棄去檢測(cè)孔板中的未結(jié)合裂解液-抗體混合物，洗滌后加入等體積ADHP顯色底物室溫孵育10 min, 之后各孔加10 μL停止液終止反應(yīng)，以530～540 nm為激發(fā)光波長(zhǎng)，于590～600 nm處檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度。

1.2.3TLR2受體功能性阻斷劑及受體內(nèi)吞抑制劑對(duì)oAβ42吞噬量的影響 用TLR2受體(10 μg/mL)、受體內(nèi)吞抑制劑(endocytosis inhibitor，30 μmol/L)分別作用小膠質(zhì)細(xì)胞75 min。以上不同實(shí)驗(yàn)組分別加入oAβ42(1 μmol/L)孵育1.5 h，檢測(cè)細(xì)胞中的oAβ42水平。按照試劑盒說明書提供的方法測(cè)出細(xì)胞裂解液上清中oAβ42的量，每組結(jié)果用各組細(xì)胞測(cè)定的BCA蛋白濃度進(jìn)行校正后，各組結(jié)果以對(duì)照組(只加入oAβ42孵育)細(xì)胞測(cè)得的oAβ42含量為100%換算成百分比，即被BV2細(xì)胞吞噬的oAβ42的量。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn) 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)中的計(jì)量資料以3次或3次以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t測(cè)驗(yàn)法檢驗(yàn)各組處理的差異顯著性。當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01時(shí)認(rèn)為差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 模式識(shí)別受體激活對(duì)p38-MAPK磷酸化水平的影響

首先利用小膠質(zhì)細(xì)胞的非特異性配體巖藻糖(100 μg/mL)與特異性配體oAβ(20 μg/mL)作用小膠質(zhì)細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞p38絲裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)的磷酸化程度。結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞受到模式識(shí)別受體的非特異性配體巖藻糖活化后，磷酸化水平顯著增加(P<0.01)，使用較高濃度的oAβ42(20 μg/mL)激活細(xì)胞模式識(shí)別受體后，由于吞噬等一系列作用，引發(fā)p38-MAPK磷酸化水平升高。同時(shí)觀察到兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組中小膠質(zhì)細(xì)胞由細(xì)長(zhǎng)突起靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形或橢圓形的活化狀態(tài)。

圖1 巖澡糖與寡聚形態(tài)Aβ42對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞 p38-MAPK磷酸化水平的影響Fig.1 Effect of fucoidan and oligomer Aβ42 activate on p38-MAPK phosphorylation level in micorglia.注：**表示與單獨(dú)細(xì)胞組相比差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。

2.2 模式識(shí)別受體的阻斷降低oAβ42誘導(dǎo)的p38-MAPK磷酸化水平

分別采用小膠質(zhì)細(xì)胞表面受體SRA、SRB、CD36、TLR2的功能性抗體預(yù)先作用小膠質(zhì)細(xì)胞，使上述受體被中和，再測(cè)定上述特定實(shí)驗(yàn)組的小膠質(zhì)細(xì)胞被Aβ42(oAβ42)刺激引起的p38-MAPK磷酸化水平變化。結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明，2 μmol/L的oAβ42作用小膠質(zhì)細(xì)胞可以明顯提高p38-MAPK的磷酸化水平的熒光值，相同條件實(shí)驗(yàn)組中事先分別用10 μg/mL的SRA、SRB、CD36、TLR2受體功能性阻斷劑處理細(xì)胞再加入oAβ42，p38-MAPK磷酸化水平均降低，其中，SRA和TLR2抗體處理組p38-MAPK磷酸化水平經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)與對(duì)照組(oAβ42單獨(dú)處理組)具有極顯著性差異(P<0.01)。

2.3 TLR2受體功能性阻斷劑對(duì)oAβ42吞噬的影響

已有研究證實(shí)清道夫家族SRA受體參與小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)oAB42的吞噬過程[4]，而TLR2作為典型的病原識(shí)別性受體，與之相關(guān)的p38-MAPK磷酸化過程對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬的影響還不明確，為進(jìn)一步探討該p38-MAPK信號(hào)對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞攝取oAβ42過程的影響，用TLR2受體特異性抗體處理小膠質(zhì)細(xì)胞，檢測(cè)TLR2受體中和后oAβ42的細(xì)胞吞入水平并與正常小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)比。另外，為探討上述模式識(shí)別受體激發(fā)的磷酸化過程是否與經(jīng)典的受體內(nèi)吞過程相關(guān)，同時(shí)檢測(cè)受體內(nèi)吞抑制劑(endocytosis inhibitor)處理對(duì)細(xì)胞攝取oAβ42過程的影響，結(jié)果如圖3所示,TLR2受體中和后oAβ42的細(xì)胞吞入水平與正常小膠質(zhì)細(xì)胞相比顯著降低。受體內(nèi)吞抑制劑(endocytosis inhibitor)可通過作用于細(xì)胞內(nèi)吞必須的網(wǎng)格蛋白抑制經(jīng)典細(xì)胞的內(nèi)吞過程，但該抑制劑對(duì)上述oAβ42的細(xì)胞吞入過程后的細(xì)胞內(nèi)oAβ42蛋白測(cè)定結(jié)果沒有顯著影響，上述結(jié)果說明模式識(shí)別受體對(duì)oAβ42的清除過程不屬于經(jīng)典的細(xì)胞內(nèi)吞過程。

圖2 模式識(shí)別受體阻斷劑抑制oAβ42誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞p38-MAPK磷酸化過程Fig.2 PRR blocking antibodies reduce the level of p38-MAPK phosphorylation in micorglia.注：**表示與oAβ42單獨(dú)處理組的小膠質(zhì)細(xì)胞相比差異極顯著(P<0.01)。

圖3 TLR2受體特異性抗體及受體內(nèi)吞抑制劑 對(duì)于oAβ42攝取的影響Fig.3 The influence of TLR2 blocking antibody and endocytosis inhibitor on oAβ42 internalization in microglia.注：*表示與oAβ42單獨(dú)處理組相比差異顯著(P<0.05)。

3 討論

目前AD主要通過增加神經(jīng)遞質(zhì)的藥物對(duì)癥治療延緩臨床癥狀，尚缺乏對(duì)因治療的手段[5]。小膠質(zhì)細(xì)胞在AD進(jìn)程中是一把雙刃劍[6]，其中吞噬激活的狀態(tài)決定了病程的走向[7]，小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬失能是AD的重要病因之一[8]，激活腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞或引入外周小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)腦內(nèi)錯(cuò)誤折疊的Aβ42蛋白進(jìn)行清除是極具希望的AD免疫療法[6]。有研究表明p38-MAPK的磷酸化激活與小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬過程的肌動(dòng)蛋白絲運(yùn)動(dòng)相關(guān)，而其抑制劑可以減弱細(xì)胞的吞噬[7]，本研究中首先利用巖藻糖與oAβ42作為誘導(dǎo)物作用于小膠質(zhì)細(xì)胞，觀察到該細(xì)胞p38-MAPK的磷酸化激活現(xiàn)象，巖藻糖是來(lái)自褐藻的一種多聚陰離子多糖[9]，該多聚陰離子結(jié)構(gòu)正是膠質(zhì)細(xì)胞模式識(shí)別受體家族的共同識(shí)別域，因此屬于非特異性配體，已有研究證實(shí)其可減緩注射Aβ蛋白的AD模型大鼠中學(xué)習(xí)與記憶功能的損害，該作用可能是由于其受體占位作用，而阻止了Aβ蛋白的模式識(shí)別受體過強(qiáng)毒性而產(chǎn)生，巖藻糖引起了較高的p38-MAPK的磷酸化水平，證實(shí)了模式識(shí)別受體激活后膠質(zhì)細(xì)胞的活化作用。進(jìn)一步地，在模式識(shí)別受體SRA及TLR2受體被相應(yīng)抗體阻斷的小膠質(zhì)細(xì)胞在受到Aβ42蛋白激活后引起p38-MAPK的磷酸化水平比對(duì)照組顯著降低，說明SRA受體以及TLR2受體參與了oAβ42引起的p38-MAPK磷酸化過程。小膠質(zhì)細(xì)胞的模式識(shí)別受體(PRR)的兩類受體(病原感受器受體家族和清道夫受體家族[10])分別司職異物的識(shí)別與清除，并通過交互作用完成固有免疫過程，但是目前還不清楚清道夫受體如何調(diào)節(jié)其配體作用后的最終效應(yīng)，一種可能是SR的存在為其配體轉(zhuǎn)移到其他的PRR(尤其是TLRS)提供了便利[11]。但與此矛盾的是，在CD14、TLR2、TLR4基因缺失的動(dòng)物中，分離的小膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)法誘發(fā)p38-MAPK的磷酸化，也暗示了病原感受器缺失的小膠質(zhì)細(xì)胞傳遞吞噬信號(hào)的失能[12]，則TLRS家族受體信號(hào)產(chǎn)生在SR家族受體信號(hào)之前。一項(xiàng)阿爾茨海默病的小膠質(zhì)細(xì)胞基因網(wǎng)絡(luò)研究表明[13]，小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)由5種途徑組成的固有免疫體系參與并影響該疾病的進(jìn)程：病理蛋白清除系統(tǒng)(清道夫受體系統(tǒng))、病理蛋白識(shí)別系統(tǒng)(Toll樣受體家族)、輔助病理蛋白清除系統(tǒng)(補(bǔ)體系統(tǒng))、細(xì)胞通訊系統(tǒng)(趨化因子系統(tǒng))和自身標(biāo)志系統(tǒng)(MHC分子系統(tǒng))。本研究中，觀察到屬于膠質(zhì)細(xì)胞中病理蛋白識(shí)別系統(tǒng)的TLR2受體的抑制直接降低了小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬量，說明病原感受型受體雖然本身并不直接參與吞噬過程，但其失能會(huì)直接影響膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)病理性蛋白的清除，另外，該過程采用經(jīng)典受體內(nèi)吞抑制劑(網(wǎng)格蛋白抑制劑，endocytosis inhibtor)處理細(xì)胞，對(duì)于oAB42的吞入量影響并不顯著，提示上述TLR2引發(fā)的p38-MAPK信號(hào)相關(guān)的蛋白清除現(xiàn)象屬于受體激發(fā)的吞噬過程(receptor initiated phagocytosis)[14]，而不是傳統(tǒng)意義上由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的受體內(nèi)吞(receptor-mediated endocytosis)形式[15]。本研究證實(shí)，模式識(shí)別受體TLR2參與小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬激活所必須的p38-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程影響了病理蛋白的清除量，提示該受體家族有望成為AD免疫治療的干預(yù)靶標(biāo)。

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