甲殼素酶的研究進展

徐田甜，侯是媛，齊斌，鄭麗雪，季亞美，李政洪，王立梅*

1(常熟理工學(xué)院，蘇州市食品生物技術(shù)重點實驗室，發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，江蘇 常熟，215500) 2(蘇州大學(xué) 醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，江蘇 蘇州，215123)

甲殼素又叫幾丁質(zhì)，是由β-1，4糖苷鍵連接的N-乙酰-D-氨基葡萄糖高分子多聚體[1]，是自然界中唯一的天然帶正電荷的多糖，每年自然界中儲存量超過百億噸，僅次于纖維素[2]。但甲殼素分子量極大，不溶于水，只溶于濃酸，這極大地限制了甲殼素的應(yīng)用。目前降解甲殼素生成甲殼低聚糖的方法主要有化學(xué)法、物理法和酶法等?；瘜W(xué)法主要有酸解法和氧化法，這2種方法反應(yīng)條件比較嚴(yán)苛，反應(yīng)產(chǎn)物不均一，產(chǎn)品穩(wěn)定性差，對環(huán)境污染嚴(yán)重。物理法主要是利用微波、超聲波等產(chǎn)生巨大能量使得β-1，4糖苷鍵等化學(xué)鍵大量斷裂從而生成低分子量的甲殼低聚糖，其產(chǎn)品均一，穩(wěn)定性好，對環(huán)境污染少[3]。VASILIEVA等[4]利用低溫電子束等離子體(EBP)降解甲殼素，研究表明EBP對甲殼素的作用降低了其結(jié)晶度指數(shù)和聚合度。但物理方法生產(chǎn)成本比較高，應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)可能性較低。酶法則是通過專一性或非專一性酶水解甲殼酶，非專一性酶包括纖維素酶、溶菌酶、脂肪酶等。甲殼素酶是降解甲殼素的專一性酶，能斷裂甲殼素的β-1,4糖苷鍵使其水解生成N-乙酰葡糖胺[5-6]。與非專一性酶作用比較，專一性甲殼素酶酶解法反應(yīng)溫和，產(chǎn)品均一，對環(huán)境沒有污染，大量節(jié)省生產(chǎn)成本和時間。因此，專一性甲殼素酶越來越受到人們的重視，本文主要對甲殼素酶的研究現(xiàn)狀進行綜述。

1 甲殼素酶的來源

能產(chǎn)生甲殼素酶的生物很多，包括微生物、動物、植物等。1905年，BENECKE首次發(fā)現(xiàn)幾丁芽孢桿菌(Bacilluschitinovirous)能分解利用甲殼素[2]。1921年，F(xiàn)OLPMERS發(fā)現(xiàn)某些細菌和真菌能利用甲殼素在瓊脂平板上形成水解圈，進而證明了甲殼素酶的存在[2]。1929年時，KARRER和HOFFMAN又在蝸牛體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了甲殼素酶[2]。之后，人們發(fā)現(xiàn)有一些病毒也能產(chǎn)甲殼素酶。

近年來，對產(chǎn)甲殼素酶的微生物研究越來越多。產(chǎn)甲殼素酶的微生物包括細菌、放線菌和真菌等，其中主要包括粘質(zhì)沙雷氏菌、芽孢桿菌、假單胞菌以及鏈霉菌等[7-10]。LU等[11]從黃瓜根部分離到1株新型稀有放線菌SaccharothrixyanglingensisHhs.015，將甲殼素酶的基因片段在大腸桿菌中過表達，產(chǎn)生的可溶性蛋白Chi6769(77.9 kDa)對真菌蘋果腐爛病菌(Valsamali03-8)有強烈的抑制作用。SONG等[12]在腐爛蘑菇的土壤里分離到1株新型的耐冷甲殼素酶生產(chǎn)菌Pedobactersp.,25 ℃下，其產(chǎn)生的甲殼素酶的酶活最高，該甲殼素酶對立枯絲核菌和灰葡萄孢菌的抑制率分別達到60.9%和57.5%，這種甲殼素酶PR-M6在低溫下防治植物病原體表現(xiàn)出了極大的潛力。BOUACEM等[13]研究發(fā)現(xiàn)嗜熱氫化嗜麥芽寡頭菌株KB-DZ44中能產(chǎn)耐高溫的甲殼素酶ChiA-Hh59，純化后的甲殼素酶在60 ℃溫育36 h后其最大酶活為3 000 U/mL。

2 甲殼素酶的分類

甲殼素酶有多種分類方法，可根據(jù)其分泌性、切口位置、等電點以及氨基酸序列的不同來分類。

2.1 分泌性

根據(jù)甲殼素酶的分泌性可分為胞內(nèi)甲殼素酶和胞外甲殼素酶，絕大多數(shù)的微生物所產(chǎn)的甲殼素酶都為胞外酶[14]。因此在做甲殼素酶菌株篩選時，大多采用比較水解圈大小來選擇目標(biāo)菌株。這種甲殼素酶都是屬于誘導(dǎo)型的，即在底物甲殼素的誘導(dǎo)下向胞外分泌酶來降解底物生成殼寡糖或單糖再進行利用[2，15]。

2.2 切口位置

根據(jù)甲殼素酶的切口位置以及初級產(chǎn)物不同，可以分為甲殼素內(nèi)切酶和甲殼素外切酶。甲殼素內(nèi)切酶從甲殼素糖鏈內(nèi)部隨機切斷，水解產(chǎn)物為二糖或寡糖等[16]。而甲殼素外切酶是從甲殼素的非還原端依次切斷得到單糖[17]。

2.3 等電點

按照酶等電點的不同，可以將甲殼素酶劃分為酸性、中性和堿性甲殼素酶。微生物產(chǎn)的甲殼素酶多為酸性酶，而植物產(chǎn)的甲殼素酶多為堿性酶，也有少部分產(chǎn)酸性酶，且二者有可能出現(xiàn)在同一植株中[18]。

2.4 氨基酸序列同源性

根據(jù)氨基酸序列的同源性，甲殼素酶被分為18和19兩個家族。18家族的甲殼素酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，而19家族的甲殼素酶主要存在植物內(nèi)，在少部分放線菌中也有存在。18家族的甲殼素酶的催化區(qū)域都包括2個Asp和1個Glu，其應(yīng)該為18家族甲殼素酶的關(guān)鍵活性氨基酸[19-20]。18家族甲殼素酶的水解產(chǎn)物與19家族甲殼素酶的水解產(chǎn)物完全不同，18家族的甲殼素酶的水解產(chǎn)物都是β異構(gòu)體，而19家族的甲殼素酶的水解產(chǎn)物均為α異構(gòu)體[18]。18、19家族的甲殼素酶的催化機制差別也很大，且完整的催化機制有待進一步研究[20-21]。

3 甲殼素酶的分子生物學(xué)研究

在甲殼素酶的分子生物學(xué)研究中，研究最多的為甲殼素酶基因的克隆表達，通常將細菌甲殼素酶基因在大腸桿菌系統(tǒng)中表達，將真菌甲殼素酶基因在酵母系統(tǒng)中表達。而常規(guī)來源的篩選方法并不能快速地篩選到高效產(chǎn)酶基因。因此有部分研究者采用隨機突變的方法進行高通量篩選或?qū)蚨c突變，從而篩選到優(yōu)良性狀的產(chǎn)酶基因。為了研究甲殼素酶的功能和性質(zhì)，部分研究者通過構(gòu)建基因缺失突變體來進行研究。

3.1 隨機突變

CHEN等[22]為了提高來自秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的甲殼素酶的降解能力和殺死線蟲的活性，通過易錯PCR技術(shù)構(gòu)建了一個隨機突變體文庫進行高通量篩選。突變型甲殼素酶的半數(shù)致死濃度與野生型相比降低20%，殺死線蟲的活性大大提升。研究還發(fā)現(xiàn)，突變型甲殼素酶減少了底物與底物結(jié)合位點Asp141之間的距離，最終導(dǎo)致底物親和力，催化效率和比活性的增加。

3.2 定點突變

定點突變是一種高效快速改變目的基因表達蛋白的產(chǎn)量和性狀的方法，通常采用PCR的方法向目的基因中引入所需的變化，通常為堿基的替換、增減等。FAN等[23]研究發(fā)現(xiàn)Lymantriadispar幾丁質(zhì)酶中的2個天冬氨酸殘基(D143，D145)和1個色氨酸(W146)是在家族18幾丁質(zhì)酶催化區(qū)的第2個保守基序內(nèi)觀察到的高度保守的殘基，其從L.dispar克隆了幾丁質(zhì)酶cDNA LdCht5，并且使用定點突變的方法用其他3種氨基酸分別、組合、全部取代3種殘基制備7種突變型甲殼素酶，研究發(fā)現(xiàn)突變酶酶活穩(wěn)定的pH范圍變廣，在特定pH值下，突變型甲殼素酶的穩(wěn)定性優(yōu)于野生型。

3.3 基因缺失突變體

反向遺傳學(xué)經(jīng)常通過制備目的基因功能缺失突變體來研究該基因的功能，CRISPR/Cas9工具基因編輯工具以及RNA干擾技術(shù)是目前常用的制備方法[24]。SUN等[25]利用CRISPR/Cas9工具敲除脊尾白蝦的幾丁質(zhì)酶基因(EcChi4)來制備EcChi4基因的功能缺失體從而研究EcChi4基因的免疫防御功能。研究發(fā)現(xiàn)，在受到副溶血性弧菌或嗜水氣單胞菌攻擊時，EcChi4缺失組的蝦的死亡率顯著高于野生型組，由此證明EcChi4基因具有免疫防御功能。RNAi(RNA干擾)是通過序列特異性方式沉默靶基因的技術(shù)。GANBAATAR等[26]選擇幾丁質(zhì)酶基因作為靶基因，將靶基因的干擾序列克隆到L4440載體中以產(chǎn)生序列特異性dsRNA(雙鏈 RNA)，將重組L4440載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株 HT115(DE3)中，將基因工程菌直接喂養(yǎng)給受體昆蟲Mythimnaseparata。研究發(fā)現(xiàn)口服大腸桿菌表達的dsRNA的受體昆蟲也會發(fā)生RNAi效應(yīng)，M.separata內(nèi)源性基因表達被沉默，M.separata的甲殼素酶基因缺失突變體的死亡率增加和幼體體重下降。上述研究結(jié)果表明甲殼素酶具有抑菌活力，提高免疫防御以及促進昆蟲發(fā)育等功能。

4 固定化甲殼素酶

為了使甲殼素酶廣泛應(yīng)用于工業(yè)化，其固定化研究也越來越受人們關(guān)注。MOHAMMADZADEH等[27]將純化的Chit36酶固定在Ca2+交聯(lián)的海藻酸鹽/海泡石(AlgSep)納米復(fù)合物珠粒中，以改善生物催化過程期間Chit36酶的催化活性和穩(wěn)定性，研究發(fā)現(xiàn)藻酸鹽納米復(fù)合物珠中的Chit36的催化活性比不含海泡石的藻酸鹽珠粒中的固定化Chit36高，該項研究在制藥等工業(yè)上具有廣泛的應(yīng)用前景。

5 甲殼素酶的應(yīng)用

5.1 農(nóng)業(yè)

甲殼素酶具有抗蟲和抗真菌作用，由于真菌細胞壁和昆蟲骨骼中都含有大量的甲殼素，在甲殼素酶的作用下水解甲殼素造成真菌和害蟲的死亡[28-30]。甲殼素酶可以用來解決由害蟲和真菌作用導(dǎo)致的農(nóng)作物減產(chǎn)問題，同時不會對環(huán)境造成污染和損害。用幾丁質(zhì)酶分解植物病原體進行的生物防治在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用越來越受到重視。GURAV等[31]從貝類加工工業(yè)土壤中分離出2種不同的菌株RST25和SUK25可以分解甲殼素，RST25酶活較高并被鑒定為短小芽孢桿菌，在體外測定中，短小芽孢桿菌RST25能顯著抑制植物病原菌Fusariumsolani和Aspergillusniger，短小芽孢桿菌RST25及其產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶可以作為抗真菌植物病原體的生物防治劑。除此以外，將甲殼素酶基因轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物中構(gòu)建轉(zhuǎn)基因食品的研究越來越受到人們的關(guān)注。KHAN等[32]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將甲殼素酶基因重組到馬鈴薯內(nèi)開發(fā)了過表達內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯(品種Desiree)，研究表明轉(zhuǎn)基因馬鈴薯能顯著抑制植物病原真菌包括鏈格孢菌(Alternariasolani)的生長。KHAN等[33]將甲殼素酶基因(NiC)轉(zhuǎn)化到甘藍型油菜中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜能抑制常見真菌病原體交鏈孢菌(Alternariabrassicicola)的活性?？拐婢D(zhuǎn)基因食品對環(huán)境的影響廣受關(guān)注。KHAN等[33]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜與非轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜之間的土壤酶活性沒有明顯差別，對根際土壤進行微生物多樣性分析發(fā)現(xiàn)NiC甘藍型油菜品系可能不會影響根際土壤的微生物活性和群落結(jié)構(gòu)。品種之間根際土壤進行微生物多樣性的差異可能是測試參數(shù)的微小變化導(dǎo)致。甲殼素酶轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物能有效抵抗植物病原體的侵害，大大提高產(chǎn)量，同時并未對環(huán)境造成影響，具有很廣闊的農(nóng)業(yè)應(yīng)用前景。

5.2 畜牧業(yè)

自然界中甲殼素含量很高，但目前對甲殼素利用度很低。含有甲殼素的生物體被認(rèn)為是新型動物飼料資源，但動物無法消化甲殼素，這就極大地限制了甲殼素在畜牧業(yè)上的應(yīng)用。TABATA等[34-35]研究發(fā)現(xiàn)酸性甲殼素酶(Chia)可以在小鼠，雞和豬胃組織中高度表達，并且它可以在動物的胃腸道(GIT)中消化甲殼素，且酸性甲殼素酶(Chia)可以對胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的蛋白水解活性產(chǎn)生抗性，這意味著在動物胃中成功表達的甲殼素酶并不會輕易被蛋白酶水解。酸性甲殼素酶可以作為動物飼料添加劑，可以將甲殼素制成動物可食用飼料，提高甲殼素利用率。

5.3 工業(yè)

甲殼素酶的工業(yè)化生產(chǎn)一直是人們的研究重點。KIDIBULE等[36]將來自Trichodermaharzianum的甲殼素酶Chit42基因在巴斯德畢赤酵母中表達，采用分批補料的發(fā)酵方法，甲殼素酶的產(chǎn)量可以達到約3 g/L。KIM等[37]在從韓國本土小牛糞便中分離出幾丁質(zhì)酶Escherichiafergusonii菌株，在pH值為7.0和30 ℃的最適條件下，深層發(fā)酵幾丁質(zhì)酶活達到最大，為7.24±0.07 U/mL。在這項研究中，發(fā)現(xiàn)蔗糖，酵母提取物，(NH4)2SO4和NaCl可能會提高外切幾丁質(zhì)酶的活性。AOUNALLAH等[38]運用響應(yīng)面法優(yōu)化地衣芽孢桿菌AT6菌株(BacilluslicheniformisAT6 Strain)的發(fā)酵培養(yǎng)基，將初始甲殼素酶的酶活提高近10倍達到505.26±22.22 mU/mL。目前對甲殼素酶的工業(yè)化研究都集中在提高甲殼素酶的酶活上，對利用甲殼素酶生產(chǎn)殼寡糖的研究較少。

6 展望

甲殼素酶具有良好的抗菌抗蟲特性，在生物防治上具有廣闊的應(yīng)用前景。甲殼素酶還能快速降解甲殼素幫助生物體消化利用甲殼素，提高自然界中甲殼素的利用率。而工業(yè)化生產(chǎn)穩(wěn)定性好、酶活高的甲殼素酶是一直困擾人們的難題。因此，人們從工業(yè)發(fā)酵條件、固定化方法、異源表達高產(chǎn)酶基因等方面進行研究，以促進發(fā)展甲殼素酶工業(yè)化步伐[39-40]。

目前，雖然甲殼素酶已經(jīng)商業(yè)化，但其發(fā)酵水平較低，發(fā)酵成本較高，這將限制甲殼素酶的廣泛應(yīng)用。一方面，要尋找甲殼素酶新的來源和低價培養(yǎng)基，在提高甲殼素酶發(fā)酵水平的同時降低發(fā)酵成本；另一方面，要深入研究利用甲殼素酶發(fā)酵生產(chǎn)殼寡糖的技術(shù)，提高酶法產(chǎn)殼寡糖的產(chǎn)量和純度。