毛細(xì)管電泳分離測定維生素的研究進(jìn)展

張 鋒

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

維生素是維持人體正常代謝功能所必需的生物活性物質(zhì)，現(xiàn)階段所知的維生素就有幾十種，大致分為脂溶性和水溶性兩大類。維生素的一般測定方法多采用分光光度法、熒光法、高效液相色譜法。分光光度法和熒光法因干擾因素多，無法同時(shí)測定的多種維生素，需要多種方法的交替使用才能完成，不利于快速分析。高效液相色譜法因要配制不同的流動(dòng)相、檢測器，運(yùn)行成本高，分析時(shí)間長而受到一定的限制。

高效毛細(xì)管電泳(HPCE)技術(shù)是近年來分析化學(xué)中發(fā)展迅速的領(lǐng)域之一，它以高壓電場為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間濃度和分配行為上的差異，而實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。它兼有高壓電泳的高速、高分辨率等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又因樣品預(yù)處理簡單、準(zhǔn)確靈敏、操作簡便、溶劑用量少、對(duì)環(huán)境污染小等特點(diǎn)，越來越多的應(yīng)用于醫(yī)藥科學(xué)、食品檢測、生命科學(xué)等領(lǐng)域?，F(xiàn)對(duì)近年來運(yùn)用毛細(xì)管電泳分離檢測維生素的現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，并對(duì)各方法進(jìn)行歸納。

1 毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(Capillary Zone Electrophoresis,CZE)

1.1 CZE-UV

大部分維生素分離測定，尤其是水溶性維生素均使用CZE-UV方式。一般硼酸鹽緩沖液濃度選擇在10～60mM之間，pH值在8.0～10.0之間。

胡曉琴等[1-2]采用雙模對(duì)接的方法獲得超高電壓，在40.0kV高壓下，25mmol/L硼砂-硼酸緩沖液(pH值=8.8), 檢測波長214nm，對(duì)菠菜和荔枝中8種水溶性維生素在2.2 min內(nèi)獲得了較好的基線分離。陳興國等[3]使用毛細(xì)管長度為30cm(有效長度26.5cm)，檢測波長為265nm，20mmol/L的NaH2PO4緩沖溶液(pH值=7.1)，運(yùn)行電壓10.0kV，可使維生素C等三種物質(zhì)在5min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離。于海霞等[4]以4 mmol/L奎寧甲醇溶液作為背景吸收物質(zhì)，以20mmol/L NaH2PO4溶液(pH值=2.7)作為運(yùn)行緩沖溶液，運(yùn)行電壓10 kV，檢測波長218 nm，對(duì)減肥膠囊中維生素BT進(jìn)行含量測定。

1.2 CZE-EC/ECL

毛細(xì)管電泳與電化學(xué)發(fā)光(Electrochemiluminescene，ECL)或電化學(xué)(Electrochemical，EC)檢測聯(lián)用,靈敏度高、線性范圍較寬、選擇性高，目前常用于氨基酸、胺類藥物的測定。

崔悅等[5]在堿性條件下對(duì)VB1水解后采用ECL檢測，可極大地增強(qiáng)其ECL信號(hào),利用CE法對(duì)VB1和VB6進(jìn)行分離，聯(lián)合應(yīng)用ECL和EC檢測對(duì)兩種維生素同時(shí)進(jìn)行定量測定。ECL檢測池中為含5mmol/L Ru(bpy)3的100mmol/L PBS(pH值=8.5)，檢測電位為1.25V，分離緩沖溶液為含12%乙腈的10mmol/L PBS(pH值=8.90)，分離電壓為20kV，光電倍增管高壓設(shè)為-850V。復(fù)合B藥品中VB1和VB6能在5min內(nèi)得到良好的分離。

朱金坤等[6]基于維生素對(duì)魯米那-雙氧水體系良好的化學(xué)發(fā)光催化活性, 研究確立了一種新型毛細(xì)管電泳-化學(xué)發(fā)光檢測方法, 用于這一物質(zhì)的準(zhǔn)確分析。經(jīng)過預(yù)處理使VB12在luminol-H2O2發(fā)光體系中獲得良好的催化信號(hào)，緩沖液為：30%ACN+70%0.01mmol/L NaOH+0.16mmol/L乳酸+0.001mmol/L luminol。

Peng.He等[7]對(duì)大鼠腹腔肥大細(xì)胞預(yù)處理后，采用CE-ED方式測定VC，用0.1% SDS作為細(xì)胞溶解液，緩沖液為：1.83×10-2mol/LNa2HPO4-1.70×10-3mol/LNaH2PO4(pH值=7.8),電壓20kV。

X.M.Sun等[8]采用CE-ED測定大鼠肝細(xì)胞中VC，用0.1%SDS作為細(xì)胞溶解液，緩沖液為：1.83×10-2mol/L Na2HPO4-1.70×10-3mol/L NaH2PO4(pH值=7.8),電壓20kV。方法簡單、易操作，靈敏度強(qiáng)。

1.3 CZE-LIF

激光誘導(dǎo)熒光(laser induced fluorescence，LIF)檢測是當(dāng)前較高靈敏度的檢測技術(shù)之一，由于激光光束方向性很高，LIF 能夠用于微量特別是痕量檢測，LIF 還具有很高的選擇性，僅僅能夠檢測熒光物質(zhì)或被選擇性熒光標(biāo)記的物質(zhì)，可以有效消除基體成分的干擾。

張暉等[9]選擇分離電壓為20 kV，pH值=9.24的37.5mmol/L硼砂溶液為緩沖溶液，采用55cm(40cm處檢測窗口)×75μm熔融石英毛細(xì)管作為分離通道，激光誘導(dǎo)熒光檢測器于激發(fā)波長488 nm 選擇性地檢測VB2。

M.L.Wu等[10]用微芯片電泳結(jié)合LIF檢測(MCE-LIF)測定功能性飲料中氨基酸和VB3，將待測物質(zhì)稀釋后與Cy5衍生化(1∶1，v/v),z置于硼酸鹽緩沖溶液100mM中(pH值=9.88)，在4min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了快速分離,檢測濃度低至0.2～0.5nM。

D.Zhao等[11]采用衍生化的方法，用LIF檢測器測定了健康飲料中三種氨基酸和葉酸、VB6、煙酸，采用25mmol/L硼酸鹽緩沖液(pH值=9.85)，電壓22kV，最低檢測限為0.5nM。

1.4 CZE-MS

1987年，Jose等[12]首次建立了CE-MS(Mass Spectrometry)聯(lián)用技術(shù)。由于具備高分離效率、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，目前CE-MS仍是CE研究中的重大方向之一。

K.Maráková等[13]采用電噴霧離子源(ESI),串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜，電泳液為50mmol/L甲酸溶液(pH值=2.05),在16min內(nèi)分離測定VB1、VB2、VB12等9種B族維生素，此方法比紫外檢測更具敏感性和選擇性，與HPLC相比成本低，操作簡單、靈活、環(huán)保。

J.H.Chen等[14]對(duì)將CE與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用(CE-ICP-MS),對(duì)VB12和羥鈷胺素進(jìn)行測定，將25nM Tris緩沖液+15mM SDS作為電泳液，電壓20kV，VB12的檢測限為0.3ng。

2 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(Micellar electrokinetic chromatography MEKC)

唐俊等[15]采用膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳(MEKC)法測定維生素B4的含量, 電泳緩沖液為2.0×10-2mmol/L硼砂-硼酸緩沖液(pH值=8.40),含2.5 %(v/v)甲醇及10mmol/L SDS,在電泳電壓20kV和檢測波長254nm的條件下，成功測定了血清和尿液中VB4的含量。

D.da Silva等[16]采用MEKC方法，條件為10.0%(v/v)乙醇，2.0%(w/v)SDS，0.02mM硼酸緩沖液(pH值=8.70)，紫外檢測波長為214nm，在18min內(nèi)VC、VB2、VB12等10種水溶性維生素得到了很好的分離測定。

M.Navarro-Pascual-Ahuir等[17]測定運(yùn)動(dòng)和能量飲料中包括VC、VB1、VB12等7種水溶性維生素,進(jìn)行了分離測定，采用40mM硼酸鹽緩沖液+5%(v/v)MeOH+40mM SDS作為運(yùn)行液，pH值=8.5，25kV，紫外檢測214nm。

3 微乳毛細(xì)管電動(dòng)色譜(Microemulsion electrokinetic chromatography，MEEKC)

I.Oledzka等[18]對(duì)食物中四種脂溶性維生素測定，緩沖液組成為：25mM磷酸鹽緩沖液+異丙醇(16.2g)+正丁醇(6.6g)+SDS(2.883g)+辛烷(0.8g)，操作電壓12kV,紫外檢測280nm，25min內(nèi)分離測定，認(rèn)為此種方法在分離測定脂溶性維生素方面具有靈敏性和獨(dú)特性。

C.Yin等[19]對(duì)多維藥片中的13種水溶性和脂溶性維生素用MEEKC方法測定，基線分離好，操作簡便。運(yùn)行液為：1.2%(w/w)SDS+21%(v/v)正丁醇+18%(v/v)乙腈+0.8%(w/w)正丁烷+20mM硼酸鹽緩沖液，pH值=8.7，25kV，紫外檢測波長為205nm。

4 電色譜(Capillary electrochromatography Capillary,CEC)

CE-EC儀器造價(jià)低廉，多用于生理液等臨床樣品的分析檢測。實(shí)驗(yàn)者往往通過修飾工作電極對(duì)CE-EC 進(jìn)行優(yōu)化，通常選用的工作電極有碳、銅、金和鉑等。工作電極選擇中應(yīng)該考慮對(duì)檢測物質(zhì)有一定響應(yīng)值，但不易被液體污染，并且經(jīng)濟(jì)。

P.Chaisuwan等[20]測定膠囊中VE含量，采用100mM Tris緩沖液(pH值=9.3)+MeOH+CAN(3∶10∶87，v/v/v),紫外檢測200nm。

H.Yamada等[21]對(duì)片劑中6種水溶性維生素和4種脂溶性維生素測定，水溶性維生素主要靠電泳分離模式，脂溶性維生素采用甲基丙烯酸酯涂層柱，1M甲酸-乙腈(3∶7，v/v)作為移動(dòng)相，采用CEC檢測，在20min內(nèi)全部得到分好的分離。

使用毛細(xì)管電泳檢測維生素的方法仍處于優(yōu)化、開發(fā)創(chuàng)新的階段，研究學(xué)者不斷提出更簡便、耗時(shí)短、干擾小的樣品前處理操作，開發(fā)可進(jìn)一步提高檢測準(zhǔn)確性、及時(shí)性與靈敏度的分析方法，為維生素的研究提供可行性依據(jù)。

[1] 胡曉琴，尤慧艷.毛細(xì)管電泳法高壓快速分離分析菠菜中的水溶性維生素[J].色譜，2010，27(6)：835-839.

[2] 胡曉琴，尤慧艷.荔枝中水溶性維生素的毛細(xì)管電泳快速分離分析[J].分析試驗(yàn)室，2010，29(3)：34-36.

[3] 陳興國，張靜珠，劉秀美.分離測定化妝品中維生素C、維生素葡萄糖苷和曲酸的流動(dòng)注射-毛細(xì)管電泳方法[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，44(5)：49-53.

[4] 于海霞，周慧等.減肥膠囊中維生素BT的毛細(xì)管電泳法測定[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2016，47(6)：786-788

[5] 崔 悅，左 明，等.毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光/電化學(xué)檢測法同時(shí)測定維生素B1和B6[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2015，31(5)：627-632.

[6] 朱金坤，舒 露，等.維生素B12的毛細(xì)管電泳-化學(xué)發(fā)光檢測研究[J].華東師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2013(5)：96-101.

[7] He P， Niu Y， Mei Z H，et al.Measurement of ascorbic acid insingle rat peritoneal mast cells using capillary electrophoresis with electrochemical detection[J].J Chromatogr B,2010,878:1093-1097.

[8] Sun X, Niu Y,Bi S,et al.Determination of ascorbic acid in individual rat hepatocyte cells based on capillary electrophoresis with electrochemiluminescence detection[J].Journal of Chromatography B,2008,870(1):46

[9] 張 暉，薛洪寶，馬 濤，等.毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光法檢測維生素B2的研究[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2017，39(1)：92-95.

[10] Wu M L， Gao F， Zhang Y，et al.Sensitive analysis of amino acids andvitamin B3 in functional drinks via field-amplified stacking with reversed-field stacking in microchip electrophoresis[J].Talanta，2015,131(131C):624-631.

[11] Zhao D，Lu M，Cai Z.Separation and determination of B vitamins and essential amino acids in health drinks by CE-LIF with simultaneousderivatization[J].Electrophoresis，2012,33(15):2424-2432.

[12] Olivares Jose A，Nguyen N T，Yonker C R，et al.On-line mass spectrometric detection for capillary zone electrophoresis[J].Anal Chem，1987,59(8):1232-1236.

[13] Maráková K，Piestansky J，Havránek E，et al.Simultaneous analysis of vitamins B in pharmaceuticals and dietary supplements by capillary electrophoresis hyphenated with triple quadrupole mass spectrometry[J].Die Pharmazie，2014,69(9):663.

[14] Chen J H，Jiang S J.Determination of cobalamin in nutritive supplements and chlorella foods by capillary electrophoresis-Inductively coupled plasma mass spectrometry[J].J Agric Food Chem,2008,56(4):1210-1215.

[15] 唐 俊，張曉麗，劉二保.膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳法測定維生素B4[J].天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29(3)：46-50.

[16] Silva D C D，Visentainer J，Souza N，et al.Micellarelectro-kinetic chromatography method for determination of the ten water-Soluble vitamins in food supplements[J].Food Anal Methods，2013,6(6):1592-1606.

[17] Navarro-Pascual-Ahuir M，Lerma-Garca M J，Simó-Alfonso E F，et al.Determination of water-soluble vitamins in energy and sport drinks by micellar electrokinetic capillary chromatography[J].Food Control,2016,63:110-116.

[18] Oledzka I，Kowalski P，Bafuch A，et al.Quantification of the level of fat-soluble vitamins in feed based on the novel microemulsion electrokinetic chromatography (MEEKC) method[J].J Sci Food Agric，2014,94:544-551.

[19] Yin C，Cao Y，Ding S，et al.Rapid determination of water- and fat-soluble vitamins with microemulsion electrokinetic chromatography[J].J Chromatogr A，2008,1193:172-177.

[20] Chaisuwan P，Nacapricha D，Wilairat P,et al.Separation of alpha- beta-,gamma-,delta-tocopherols and-tocopherol acetate on a pentaerythritol diacrylate monostearate-ethylene dimethacrylate monolithby capillary electrochromatography[J].Electrophoresis，2008,29:2301-2309.

[21] Yamada H，Kitagawa S，Ohtani H.Simultaneous separation of water- and fat-soluble vitamins in isocratic pressure-assisted capillary electrochromatography using a methacrylate-based monolithic column[J].J Sep Sci，2013,36(12):1980 -1985.