凍融胚胎移植的內(nèi)膜準備

牛志宏，馮云

(上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，上海 200025)

在全球范圍內(nèi)，凍融胚胎移植周期數(shù)量正在超過新鮮胚胎移植周期，成為輔助生育技術中胚胎移植的主要方式。凍融胚胎移植周期前恰當?shù)膬?nèi)膜準備對于移植的成敗具有關鍵作用。

一、內(nèi)膜準備方案及其選擇

1.自然周期：由自身卵泡發(fā)育產(chǎn)生的內(nèi)源性雌/孕激素完成子宮內(nèi)膜的增生和分泌期轉(zhuǎn)化。本方案只適用于排卵規(guī)律的女性。需通過超聲或激素監(jiān)測，根據(jù)女性自然排卵或血清黃體生成素(LH)峰值時間，計算胚胎移植時間。一般認為排卵發(fā)生在血清LH峰后的36～40 h。應注意尿LH陽性滯后于血清LH峰且有30%左右的假陰性，所以不應以尿LH作為排卵時間評判標準。由于此方案需患者多次監(jiān)測卵泡和血清LH，且女性的排卵周期可能受情緒、氣候等影響，所以取消率比較高。有報道采用排卵結合血清孕酮(P)的水平來決定移植時間[1]：從月經(jīng)周期第10天開始，每4天監(jiān)測卵泡一次，如卵泡消失則測血P值，≤9.36 nmol/L 定義為D0日(相當于授精日)，9.37～18.72 nmol/L為D1日，18.73～24.96 nmol/L 為D2日，24.97～31.20 nmol/L為D3日。根據(jù)P值定義的時間決定復蘇和移植D3胚胎的時機。與自然周期的胚胎種植率35.1%相比，孕酮監(jiān)測方案獲得的胚胎種植率達到42.6%，且大大減少了患者監(jiān)測的次數(shù)。

2.改良自然周期/半激素替代：鑒于自然周期監(jiān)測LH峰的不確定性，改良自然周期采用外源性HCG代替內(nèi)源性LH峰，降低了周期取消率。超聲監(jiān)測主導卵泡直徑在17～18 mm時注射HCG 5 000 U，排卵發(fā)生在HCG后36～38 h。排卵后的2 d、3 d及5 d分別復蘇及移植取卵后D2、D3的分裂期胚胎及囊胚 。

對于少數(shù)卵泡發(fā)育不良，血清雌激素水平以及子宮內(nèi)膜厚度均達到移植標準的患者，也可直接予孕酮進行內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，給孕酮日為D0日，于D3日移植卵裂期D3胚胎。其好處在于無需放棄周期，較完全激素替代方案又減少了雌激素的使用。

3.激素替代周期：適用于所有類型的患者。使用雌/孕激素序貫給藥，模擬正常月經(jīng)周期內(nèi)分泌環(huán)境，實現(xiàn)子宮內(nèi)膜增殖期-分泌期的生長轉(zhuǎn)化。從月經(jīng)周期第2～3天開始連續(xù)給與雌激素制劑2～4 mg/d，起到內(nèi)膜增生和抑制優(yōu)勢卵泡生長的雙重作用。對于少數(shù)內(nèi)膜反應不良的患者，雌激素用量可增加到6～8 mg/d，監(jiān)測內(nèi)膜厚度達到7～8 mm以上時添加孕激素制劑，實現(xiàn)內(nèi)膜的分泌期轉(zhuǎn)化。對于雌激素使用的時間，一般認為應不短于7 d，報道最長的時限可達4～5周[2]。

激素替代周期具有時間安排靈活、患者依從性好、周期取消率低的優(yōu)點，但雌/孕激素的副作用不容忽視[3]。除了惡心、乳房脹痛、頭痛等雌激素常見副反應外，口服雌激素勢必增加肝臟負擔，尤其是在我國人群有較高比例的乙肝病毒感染攜帶情況下，大劑量雌激素誘發(fā)的藥物性肝損害時有發(fā)生。另外，大劑量較長時間使用雌激素可增加血液凝固傾向，甚至導致深靜脈血栓形成。對于內(nèi)膜反應不良的患者，陰道使用17β雌二醇會顯著增加血清雌激素水平，高凝以及繼發(fā)的靜脈血栓形成風險增加。經(jīng)皮使用雌激素可避免肝臟首過效應，降低靜脈血栓發(fā)生風險，但部分使用者可發(fā)生皮膚過敏反應。

4.垂體降調(diào)節(jié)-激素替代周期：激素替代并不能完全抑制垂體功能，約有1.9%～7.4%的周期會出現(xiàn)提前排卵而被迫取消周期[4]。采用促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)進行垂體降調(diào)節(jié)后，再開始雌/孕激素的序貫給藥，則完全避免了提前排卵的風險。凍融胚胎移植的內(nèi)膜準備一般都采用長效GnRH-a進行降調(diào)，分為正常降調(diào)及深度降調(diào)[5]。正常降調(diào)主要目的是抑制自發(fā)排卵，在黃體中期注射1.25～1.875 mg GnRH-a，12～14 d后開始雌激素連續(xù)給藥；深度降調(diào)的目的是降低子宮肌瘤、子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜息肉患者的子宮局部雌激素濃度，縮小病灶，改善細胞因子環(huán)境。在月經(jīng)第1～2天注射GnRH-a 3.75 mg/次，每28 d一次，根據(jù)患者具體情況可注射1～6次。最后一次注射后28 d后開始雌激素連續(xù)給藥。

5.卵巢溫和刺激周期：對于無規(guī)律性排卵的患者，除激素替代外，也可通過溫和促排卵方案誘導卵泡發(fā)育而實現(xiàn)內(nèi)膜的準備。卵巢刺激方案可采用單純來曲唑/尿促性素或二者聯(lián)用。來曲唑是具有高度特異性、高效性的第三代芳香化酶抑制劑，在促使卵泡生長發(fā)育的同時不會消耗內(nèi)膜雌激素受體。來曲唑一般從月經(jīng)周期第3～5天開始，2.5～5 mg/d，共5 d。月經(jīng)第10天開始監(jiān)測卵泡。來曲唑半衰期短，停藥后卵泡晚期雌激素迅速上升，與雌激素受體結合，可促進內(nèi)膜增生，改善子宮內(nèi)膜的血流，到排卵時能達到受精卵種植所需的足夠內(nèi)膜厚度，為胚胎的種植提供良好的子宮內(nèi)環(huán)境。Cortinez等[6]的研究發(fā)現(xiàn)來曲唑誘導排卵周期子宮內(nèi)膜厚度和三線征與自然周期無統(tǒng)計學差異，排卵后胚胎著床期子宮內(nèi)膜胞飲泡的形成與自然周期一致，認為來曲唑?qū)ψ訉m內(nèi)膜的厚度、形態(tài)及容受性均無不良影響。但口服來曲唑后部分患者可能由于卵泡發(fā)育過快而內(nèi)膜來不及增生，因此，低劑量尿促性素促排卵也是一種選擇。一般從月經(jīng)周期第3～5天開始，37.5～75 U/d，注射5～7 d后開始監(jiān)測卵泡發(fā)育。以上方案的后期處理與改良自然周期相似。

二、內(nèi)膜準備方案的臨床結局

根據(jù)2013年[7](納入20個隨機對照研究)及2016年[8](納入33個隨機對照研究)發(fā)表的兩篇Meta分析，排除存在明顯不利于胚胎著床因素(子宮肌瘤、內(nèi)膜息肉、子宮腺肌癥、輸卵管積水等)的患者，前述5種內(nèi)膜準備方案在臨床妊娠率、胚胎種植率、胎兒活產(chǎn)率方面并無明顯差異。但如果把取消周期的數(shù)據(jù)包括在內(nèi)，以每開始治療周期為分母計算，則降調(diào)節(jié)-激素替代方案的臨床妊娠率和活產(chǎn)率明顯高于其他各組。對于特殊人群，如子宮腺肌癥、基線孕酮水平較高、隱匿性LH峰影響內(nèi)膜容受性等，降調(diào)節(jié)-激素替代方案也可獲得較其他方案更穩(wěn)定的妊娠率。

針對反復種植失敗(RIF)的患者，多個研究發(fā)現(xiàn)降調(diào)節(jié)-激素替代周期能夠改善妊娠結局[9-10]。國內(nèi)蔡美虹等[11]對118例RIF患者進行了291個周期觀察，降調(diào)節(jié)-激素替代組的臨床妊娠率27.5%、種植率19.3%、持續(xù)妊娠率83.3%，均顯著高于單純激素替代組(分別為10.0%、7.1%和43.8%)。我們先前曾報道在子宮腺肌癥患者中實施降調(diào)節(jié)-激素替代準備內(nèi)膜，獲得繼續(xù)妊娠率48.91%，顯著高于單純激素替代方案的21.38%[12]。對小鼠腺肌癥模型著床期內(nèi)膜進行RNA芯片檢測，我們發(fā)現(xiàn)降調(diào)節(jié)后的小鼠與非降調(diào)節(jié)小鼠存在359個基因表達的差異[13]。長效GnRH-a改善內(nèi)膜容受性的內(nèi)在機制可能包括[14-16]：①RIF患者機體炎癥因子表達以抗炎因子為主，雌激素對優(yōu)化種植的促炎因子分泌具有抑制作用，而GnRH-a除了可降低局部雌激素水平外，本身也可以明顯降低NK細胞的細胞毒性；②人類種植前胚胎以及子宮內(nèi)膜均有GnRH及GnRH受體的mRNA表達，GnRH-a可能直接作用于胚胎及內(nèi)膜受體進而促進胚胎的發(fā)育和種植；③GnRH-a可能增加某些子宮內(nèi)膜容受性標記物(如白血病抑制因子)的表達，增加子宮內(nèi)膜容受性，提高種植率。

三、孕酮制劑的添加和選擇

1.是否需要添加孕酮：在激素替代和降調(diào)節(jié)-激素替代周期，無內(nèi)源性孕酮故而外源性孕酮添加是轉(zhuǎn)化內(nèi)膜的必要條件；在其他方案中是否一定要添加孕酮，目前存在爭議。改良自然周期和溫和刺激周期注射HCG作為排卵扳機，其半衰期較長，可以起到促進黃體發(fā)育的作用，對于額外補充孕酮要求較低。但對于少數(shù)小卵泡排卵、內(nèi)膜分泌期轉(zhuǎn)化延遲或欠佳的患者，補充孕酮確實可以提高內(nèi)膜容受性。Bjuresten等[17]對435個進行自然周期凍融胚胎移植的患者進行隨訪，發(fā)現(xiàn)添加孕酮的患者活產(chǎn)率顯著高于不添加孕酮者(30%vs.20%)。如有條件監(jiān)測，可以根據(jù)孕酮水平?jīng)Q定是否添加外源性黃體酮；在不方便監(jiān)測的情況下，口服孕酮制劑經(jīng)濟且方便，可作為常規(guī)補充。

2.孕酮制劑的選擇：在激素替代和降調(diào)節(jié)-激素替代周期，完全依賴外源性孕激素實現(xiàn)內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，因此對孕酮制劑的要求較高。多個研究[18-19]證實，每日給予陰道黃體酮凝膠90 mg 1次、肌肉注射黃體酮50 mg 1次或每日3次陰道塞微?；S體酮膠囊(200 mg/次)，臨床結局無明顯差異。肌肉注射黃體酮有局部紅腫硬結和脂膜炎的風險，近年已經(jīng)逐漸被陰道用孕酮制劑所替代?？诜S體酮制劑由于利用度低，不能作為激素替代周期單獨孕酮用藥。在其余三種內(nèi)膜準備方案中，單純口服地屈孕酮或黃體酮膠囊已經(jīng)足夠，無需常規(guī)使用陰道或肌肉注射的孕酮制劑。

四、內(nèi)膜準備中適當?shù)脑型┞稌r間

孕酮是種植窗開啟的關鍵因素。動物模型提示，胞飲突的出現(xiàn)、消失與種植窗具有完全的同步性。胞飲突的發(fā)育單獨依靠孕酮，在孕酮的單獨作用下，胞飲突出現(xiàn)的頻率增加，代表子宮內(nèi)膜具有接受性。一般認為，卵巢刺激周期的內(nèi)膜傾向于“提前轉(zhuǎn)化”，其原因在于取卵日的孕酮已經(jīng)上升在15.6 nmol/L以上，而自然周期排卵后孕酮才開始明顯升高。在取卵周期，D3卵裂期胚胎是在孕酮暴露第5天移植，激素替代周期則大多為孕酮暴露第4天復蘇和移植D3胚胎，或在暴露第3天下午復蘇，過夜培養(yǎng)后第4天移植。

研究發(fā)現(xiàn)采用激素替代的小鼠，黃體酮注射第4天子宮內(nèi)膜發(fā)育中胞飲突與完全發(fā)育胞飲突同時存在，第5天則全部為完全發(fā)育的胞飲突[20]。Paulson等[21]發(fā)現(xiàn)，激素替代周期中胞飲突推后出現(xiàn)，表明種植窗的開放和關閉可能延遲。因此，在激素替代周期，也有方案在孕酮暴露第5天復蘇和移植D3胚胎，獲得與暴露4 d接近或更好的臨床妊娠率。路錦等[22]對1 103個激素替代-凍融胚胎移植周期的分析顯示，孕酮暴露4 d、5 d移植D3胚胎和暴露6 d、7 d移植囊胚，獲得的臨床結局并無統(tǒng)計學差異。實際上，目前的臨床實踐間接證實，胚胎移植前孕酮的暴露時間存在2天以內(nèi)的“移動期”。對于常規(guī)D3的6～8細胞期胚胎，孕酮暴露時間在3.5～5 d均可實施胚胎移植。所以，激素替代周期的凍融胚胎移植可以更靈活地安排臨床和實驗室工作。

五、子宮內(nèi)膜的不同步化

子宮內(nèi)膜與胚胎的同步性是成功妊娠的必要條件。1975年Noyes等[23]發(fā)表了排卵后逐日內(nèi)膜的組織學特征描述，是目前內(nèi)膜發(fā)育的組織學標準參照。如果按照排卵時間計算的實際內(nèi)膜與標準內(nèi)膜在組織學特征相差2 d以上，則稱之為“不同步”。不同人群的研究中，自然周期內(nèi)膜不同步的發(fā)生率在5%～50%之間。

對于內(nèi)膜不同步導致的胚胎反復種植失敗，增加孕酮暴露時間可能是解決途徑。目前能檢索到的唯一臨床干預研究是在2015年發(fā)表的[24]，研究者對至少一次有優(yōu)質(zhì)胚胎移植而未孕的IVF患者模擬人工周期內(nèi)膜準備，74個活檢周期中23個周期(23.7%)內(nèi)膜延遲2～5 d，4個周期內(nèi)膜提前；有13例患者和3例患者分別接受了2個和3個重復周期的模擬及活檢，結果均一致。在隨后的激素替代-凍融胚胎移植周期，對于內(nèi)膜延遲的患者，分別將孕酮暴露時間延長到6～8 d移植D3卵裂胚，囊胚移植則延長到9 d。臨床結局發(fā)現(xiàn)D3胚胎移植種植率并未提高，但囊胚移植的胚胎種植率大幅度提高。由于該研究樣本量較小，作者也未能分析具體原因。內(nèi)膜不同步化的評估，其對于不同發(fā)育階段胚胎種植的影響及臨床處理手段的效果，還需要更多的臨床和基礎研究。

六、薄型子宮內(nèi)膜的處理

一般將胚胎移植日內(nèi)膜厚度<7 mm定義為薄型內(nèi)膜，其病因包括宮腔手術史、宮腔結核、先天性子宮發(fā)育異常以及部分不明原因。針對宮腔粘連、結核導致的薄型內(nèi)膜，宮腔鏡手術去除病灶+大劑量雌激素修復可以起到較好效果。其他類型的薄型內(nèi)膜目前是臨床處理難點，主要集中在改善子宮內(nèi)膜血流(阿司匹林、己酮可可堿、枸櫞酸西地那非)以及具有刺激細胞生長功能的細胞因子(顆粒細胞集落刺激因子、生長激素)通過不同途徑給藥，但都缺乏明確臨床療效[25]。也有報道嘗試生物電刺激脈沖或骨髓干細胞宮腔灌注[26]，僅為少量病例，尚需進一步觀察。關于薄型內(nèi)膜的處理，本文不再贅述。

綜上所述，凍融胚胎移植周期的內(nèi)膜準備方案各有利弊，在臨床結局方面并未顯示出明顯差異。自然周期或改良自然周期需要醫(yī)生更多的經(jīng)驗和患者良好的依從性，但其藥物干預較少，安全性高；激素替代或降調(diào)節(jié)-激素替代控制周期更為簡單便利，工作安排靈活，但存在外源性激素補充的副作用風險；溫和卵巢刺激周期可作為排卵障礙或改良自然周期內(nèi)膜厚度不理想患者的替代選擇。改善凍融胚胎移植周期的臨床結局，更多關注應在找尋反復胚胎種植失敗患者內(nèi)膜因素，實現(xiàn)個體化內(nèi)膜準備方案，更大效率地利用胚胎。