CYP2A6基因多態(tài)性對胃癌術后含S-1輔助化療方案療效的影響

胃癌發(fā)病率在全球范圍居于前列，我國胃癌發(fā)病率位于惡性腫瘤的第2位，僅次于肺癌［1］。完全手術切除是局部胃癌主要治療方案，尤其是D2根治術顯著降低了亞洲胃癌患者的術后復發(fā)風險［2］。研究表明胃癌術后患者接受輔助化療可以明顯提高生存獲益［3-6］。日本研究（ACTS-GC）結果提示Ⅱ、Ⅲ期胃癌接受D2根治術后，再給予輔助S-1方案化療，可以明顯提高無復發(fā)生存期（relapse free survival，RFS）和總生存期（overall survival，OS）［5］。此后，該方案在亞洲國家被廣泛應用，并展現(xiàn)了較好的療效和安全性［7-11］。

S-1的主要活性成分是替加氟，在體內被CYP2A6基因代謝為5-FU而發(fā)揮細胞毒作用。既往有臨床研究探討CYP2A6基因多態(tài)性和S-1藥代動力學的關系，結果表明CYP2A6的變異會減弱替加氟轉化為5-FU的能力［12-15］。Kaida等［12］研究結果表明非小細胞肺癌患者接受S-1單藥或者聯(lián)合順鉑治療后，CYP2A6*4的變異導致了血漿中較低的5-FU濃度，并且增加了替加氟的曲線下面積（AUC）以及Cmax。Fujita等［13］研究也表明接受S-1治療的實體腫瘤患者中，CYP2A6突變純合子患者的替加氟清除率相對于野生型和突變雜合型的患者明顯較低。兩項近期的臨床研究分別探討了在膽管癌中S-1聯(lián)合奧沙利鉑和在胃癌和大腸癌當中S-1聯(lián)合奧沙利鉑或者伊立替康的療效。結果表明CYP2A6變異的患者相對于野生型具有較低的5-FU的AUC和Cmax［14-15］。

然而，以上研究均在國外的人群中開展，CYP2A6基因本身具有較大的種族差異，國外人群和中國人群的變異呈現(xiàn)較大的差異，因此，本研究旨在探討中國人群中CYP2A6基因多態(tài)性對胃癌術后患者含S-1輔助化療方案療效的影響。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取2007年11月至2013年5月在鄭州市人民醫(yī)院胃腸外科和腫瘤科接受治療、符合研究標準的患者200例。納入標準：依據AJCC 7.0分期系統(tǒng)，病理學分期為Ⅱ～Ⅲ，ECOG體能狀況≤2；年齡18周歲以上；無其他伴隨的惡性腫瘤或者影響治療劑量和方案的嚴重并發(fā)癥；先前未接受過化療；足夠量的外周血DNA用于分析CYP2A6的基因多態(tài)性。本研究得到鄭州人民醫(yī)院倫理委員會的批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方案及不良反應的評價 治療方案：所有患者接受D2根治性胃癌手術，術后3～6周開始輔助化療；S-1方案為：1個療程為6周方案，40 mg/m2，bid，第1～4周，休息2周；每例患者共接受8個療程的輔助化療方案。S-1的劑量依據患者的體表面積，劑量介于80～160 mg/d。如果患者出現(xiàn)3～4級血液學毒性或2～4級非血液學毒性，S-1的劑量根據臨床的具體情況進行相應調整?；颊呓邮躍-1輔助化療后定期檢查腹部CT和胸部X射線評估體內復發(fā)情況，遠期療效通過定期的隨訪，獲取RFS數(shù)據。不良反應的評價依據CTCAE 3.0標準。在不同時間段分別測定患者的全血細胞計數(shù)，血清生化檢查及相關檢查。5年內每半年檢查1次腹部CT和胸部X射線。

1.2.2 CYP2A6基因分型 取外周血5 mL，利用DNA提取試劑盒（凱杰公司，德國）提取基因組DNA，鑒定、備用。通過檢索相關數(shù)據庫，本研究選擇以下幾個能影響CYP2A6活性或表達、同時在亞洲人群中突變頻率較常見的變異位點：CYP2A6*4、*7、*9和*10，野生型即為CYP2A6*1［16］。三個多態(tài)性位點-48T＞G、6558T＞C和6600G＞T通過PCR-RFLP（酶切）方法測定。CYP2A6基因的缺失通過測序的方法測定。PCR反應使用GeneAmp PCR系統(tǒng)9700熱循環(huán)儀（Applied生物系統(tǒng)，美國）。測序應用ABI PRISM BigDye Ter?minator循環(huán)測序反應試劑盒（3.0版本），采用自動的ABI Prism 3100基因分析儀分析結果（Applied生物系統(tǒng)，美國）。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。離散型變量的比較采用泊松χ2檢驗或者Fisher精確檢驗。連續(xù)型變量比較采用單側的方差分析或者是Kruskal-Wallis檢驗。RFS的定義是從手術開始的日期到疾病復發(fā)或者任何原因引起的死亡。OS的定義是從手術開始的日期到任何原因引起的死亡。生存差異的比較通過Kaplan-Meier生存分析的對數(shù)秩檢測。不良反應的多變量分析采用二元的Logistic回歸分析，生存分析的多變量分析采用Cox風險比例模型分析。所有單變量分析中P≤0.2的變量納入多變量分析模型。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床基線資料和CYP2A6基因型

200例患者的中位年齡是57（32～83）歲，大部分患者胃癌的部位為遠端胃癌（113例，56.5%）。CYP2A6等位基因的分布頻率為：CYP2A6*1 0.45、CYP2A6*4 0.13、CYP2A6*7 0.14、CYP2A6*8 0.01、CYP2A6*9 0.21、CYP2A6*10 0.04，這些等位基因分布頻率和之前報道的亞洲人群的研究數(shù)據一致［17-18］。為了比較CYP2A6多態(tài)性對輔助S-1治療的結果的影響，本研究把CYP2A6*4、*7、*9和*10聯(lián)合作為突變組。由于CYP2A6*8編碼的酶具有完整的功能活性，因此這種類型也被認為是野生型［19］。本文將CYP2A6*1/*1或者*1/*8歸為野生型組（W/W組），CYP2A6*1/*4、*1/*7、*1/*9、*1/*10歸為野生突變組（W/V組），其他兩個突變的等位基因歸為突變組（V/V組）。這3組的分布頻率為：W/W組為24.5%（n=49），W/V組為47%（n=94）和V/V組28.5%（n=57）。3組基線臨床資料差異無統(tǒng)計學意義（表1）。中位隨訪時間是46.4（12.5～80.1）個月，W/W組的S-1治療中位時間是 11.3（2.8～13.7）個月、W/V 組是 11.3（1.4～14.3）個月、V/V組是11.4（4.2～14.0）個月（P=0.146）。W/W組的S-1劑量強度調整中位值是0.96（0.54～1.00）、W/V組是0.99（0.47～1.00）、V/V組是0.92（0.63～1.00）（P=0.329）。3組S-1總劑量（中位值）分別為23 318、26 297和24 640 mg（P=0.656）。

2.2 CYP2A6多態(tài)性與療效、預后的關聯(lián)性分析

W/W組中位隨訪時間為48.1（22.7～69.3）個月、W/V組為45.0（17.1～91.0）個月、V/V組為47.7（20.2～77.1）個月，隨訪期間各有9例、7例和1例死亡?；颊呖傮w的3年RFS和OS分別為83.1%（95%CI：77.7%～88.5%）和94.8%（95%CI：91.6%～98.0%）。

CYP2A6不同基因型患者的RFS有差異，W/W組3年RFS為95.9%（95%CI：90.4%～100%）、W/V組為83.1%（95%CI：75.3%～90.9%）、V/V組為72.5%（95%CI：60.5%～84.5%）［W/Wvs.W/V或V/V=95.9%（95%CI：90.4%～100%）vs.79.1%（95%CI，72.4%～85.8%）；P=0.015］（圖1）。經過多變量的回歸分析校正了病理分期因素后，CYP2A6基因型依然是影響RFS的明顯因素（表2）。與W/W基因型相比，W/V和V/V基因型患者的RFS明顯較差，風險比分別為3.41（95%CI：1.01～11.52；P=0.049）和4.03（95%CI：1.16～13.93；P=0.028）。

CYP2A6不同基因型患者OS的差異無統(tǒng)計學意義，W/W、W/V、V/V基因型患者的3年OS分別為100%、94.5%和90.7%（P=0.166）。

2.3 CYP2A6基因型與不良反應的關聯(lián)分析

所有患者均評估了血液學和非血液學的不良反應（表3），化療期間無4級不良反應和治療相關的死亡。最常見的血液學不良反應是嗜中性粒細胞減少癥（11.5%），最常見的非血液學不良反應是腹痛（9.0%）。W/W、W/V、V/V組3級以上血液學不良反應發(fā)生率分別為10.2%、14.9%、10.5%（P=0.628），非血液學不良反應發(fā)生率分別為12.2%、24.5%、21.1%（P=0.227）。CYP2A6不同基因型患者的血液學和非血液學的不良反應的差異無統(tǒng)計學意義（表4）。

單變量分析提示，3～4級非血液學不良反應發(fā)生的風險因素是腎臟損傷（Cockroft-Gault方程計算的肌酐清除率＜60 mL/min）、高齡（＞70歲）；未發(fā)現(xiàn)血液學不良反應發(fā)生的相關風險因素（表5）。

二元Logistic多變量回歸分析的結果表明，腎臟損傷（Ccr＜60 mL/min）是發(fā)生3～4級的非血液學不良反應的獨立風險因素（表5）。

2.4 CYP2A6基因型檢測的經濟學

在CYP2A6基因分型方面，首先要收集患者的外周血樣本并采用DNA提取試劑盒來提取DNA，每例樣本需要約35元。之后用提取的DNA來進行測序鑒定CYP2A6的基因型，每一例樣本需要約95元。因此，每例樣本進行CYP2A6基因型檢測合計約130元。

表1 入組患者的基線臨床資料 （n=200）

表1 入組患者的基線臨床資料 （n=200）（續(xù)表1）

圖1 根據CYP2A6不同基因型分組的RFS曲線

表2 無復發(fā)生存期風險因素的單變量和多變量分析

表3 入組患者不良反應事件 n（%）

表4 CYP2A6基因型和2級以上不良反應相關性的單變量分析 n（%）

表5 3/4級不良反應發(fā)生風險因素的單變量和多變量分析 n（%）

表5 3/4級不良反應發(fā)生風險因素的單變量和多變量分析 n（%）（續(xù)表5）

3 討論

本研究納入200例胃癌術后接受S-1輔助化療方案的患者，通過對CYP2A6基因的多態(tài)性位點進行基因分型進而和患者的預后進行關聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)CYP2A6基因型與含S-1化療方案的長期療效有關，突變型患者的3年RFS顯著降低。

近年來，兩個大型的Ⅲ期臨床研究（ACTS-GC和CLASSIC研究）證實了對于分期為Ⅱ～Ⅲ的胃癌患者進行D2根治術后接受術后輔助S-1化療方案可以明顯生存獲益［5］，術后輔助XELOX方案同樣可以明顯獲益［3-4］。盡管這兩個以氟尿嘧啶為基礎的方案已經明確成為公認標準的術后輔助化療治療方案，但是目前尚不明確這兩種方案的優(yōu)勢人群。因此，基于個體基因組差異的生物標記物研究用于指導輔助化療就尤為重要，以期對患者實現(xiàn)最大化生存獲益。

作為口服的氟尿嘧啶類藥物，S-1包含了替加氟，吉美嘧啶和奧替拉西鉀，三者的摩爾比例為1:0.4：1［10］。替加氟是前藥，在肝臟中主要通過細胞色素P450酶2A6（CYP2A6）代謝為5-FU，從而發(fā)揮細胞毒作用［11］。作為肝藥酶的一種，CYP2A6在人群當中具有較大的個體差異，該酶的多態(tài)性位點均伴隨著酶活性的改變：CYP2A6*2、*4、*5和*20的酶沒有功能活性。然而CYP2A6*6、*7、*9、*10、*11、*12、*17、*18和*19產生的酶的功能活性均有所下降［12-14，20］。CYP2A6的基因多態(tài)性可以影響S-1為基礎的化療方案的治療結果，但不會影響卡培他濱為基礎的化療方案的治療結果。因此，本研究的發(fā)現(xiàn)表明CYP2A6多態(tài)性和切除術后含S-1化療方案的療效顯著相關。攜帶了變異基因型的患者（W/V或V/V）使得酶的功能下降，相對于野生型的患者具有3.65倍的復發(fā)風險（P=0.032）。

首先，本研究發(fā)現(xiàn)和先前的報道一致，既往研究表明CYP2A6的基因型對轉移性或圍手術期患者接受S-1為基礎的化療方案的療效有顯著影響［21-22］。近期一項Ⅱ期研究納入術前或者術后接受了S-1加多西他賽的方案，結果表明和V/V基因型患者相比，W/W或W/V的基因型患者具有較好的無進展生存期（progression free survival，PFS）（3 年 PFS：67.6%vs.33.3%；P=0.102）和OS（5年OS：75.6%vs.33.3%；P=0.032）［22］。同樣，對于轉移性的胃癌患者接受S-1加多西他賽的方案后，不同CYP2A6基因型的患者的OS和PFS具有顯著差異［21］。攜帶CYP2A6變異基因型的患者對S-1的治療反應較差，表明CYP2A6基因型變異的患者可以從卡培他濱的治療中獲益，而不能從替吉奧的治療中獲益。該基因型是否可以用來指導切除術后的胃癌患者接受輔助的S-1方案或者XELOX方案尚需進一步的研究證實。

本研究未發(fā)現(xiàn)CYP2A6多態(tài)性和不良反應的關聯(lián)。這和先前的研究保持一致，既往研究表明在最初1～2個周期的S-1單藥或者聯(lián)合方案的患者中，不同CYP2A6基因型的患者未表現(xiàn)出不良反應上的差異［14，20］?？赡苡捎诨蛐妥儺悓τ?-FU濃度的影響是長期的，短時間之內的不良反應并沒有體現(xiàn)出來。相對于肌酐清除率（creatinine clearance rate，Ccr）水平≥60 mL/min的患者，Ccr水平＜60 mL/min的患者表現(xiàn)出較高的3級以上非血液學毒性的發(fā)生率（55.0%vs.16.7%；P=0.001）。這也和先前的報道一致［21，23］。作為S-1的1個成分，吉美嘧啶是二氫嘧啶脫氫酶（DPD）的抑制劑，DPD酶是5-FU在體內快速分解代謝的生化酶。另外，由于超過50%的吉美嘧啶通過尿液排泄，故腎臟的功能紊亂可以引起對吉美嘧啶的較多接觸，從而使得體內5-FU濃度升高［24］。Aoyama等［23］研究報道了Ccr水平＜60 mL/min無法完成連續(xù)6個月S-1輔助化療的風險因素主要是不良反應。在Ccr水平≥60 mL/min組中，6個月S-1輔助化療的完成率為72.9%，在Ccr水平＜60 mL/min組中，完成率僅為40.0%。因此，存在腎臟功能紊亂的患者在接受S-1的治療時，應該密切監(jiān)測嚴重不良反應，并考慮對S-1的劑量進行調整。在關于CYP2A6基因型檢測的費用方面，本研究結果表明每例患者的檢測費用在200元以下，患者可以接受，因此也便于后期在臨床的廣泛推廣。

本研究也存在一定局限性。首先，納入研究的樣本量較小，沒有在大樣本病例當中評估CYP2A6基因多態(tài)性的預后指導意義。另外，研究為回顧性分析，存在一定偏倚。本研究中關于S-1的藥代動力學數(shù)據未收集，因此沒有對CYP2A6基因型和S-1藥代動力學曲線的關聯(lián)性進行分析。本研究將CYP2A6的多態(tài)性分為兩組（W/Wvs.W/V和V/V），其他大部分研究并沒有這樣分組。有研究結果表明隨著突變等位基因的增加（W/Wvs.W/Vvs.V/V），血漿中5-FU的濃度呈現(xiàn)下降的趨勢［22］，另有研究報道在W/W組和W/V或V/V組中血漿5-FU的濃度差異，差異具有統(tǒng)計學意義［14-15，22］。結果的不一致可能是因為不同變異等位基因的CYP2A6酶活性差異。CYP2A6*4等位引起了CYP2A6基因的缺失，因而活性缺乏，而*7、*9和*10引起的是不同程度的酶活性的下降。基于這些數(shù)據，本研究中對CYP2A6基因型的分組是合理的。

綜上所述，CYP2A6的基因多態(tài)性和可切除的胃癌患者接受了含S-1的輔助方案的療效顯著相關。野生型也即W/W的患者相對于攜帶W/V或者V/V基因型的患者而言具有較高的RFS。當然，研究尚需要大樣本的進一步探討。

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