非小細(xì)胞肺癌組織PD-L1表達(dá)的預(yù)后意義及其與SUVmax的相關(guān)性*

肺癌是世界性疾病，每年因其死亡的人數(shù)比例居所有腫瘤的首位［1］。隨著PD-L1/PD-1抑制劑［2-4］在晚期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）中應(yīng)用取得了顯著療效，PD-L1表達(dá)的預(yù)后意義備受關(guān)注。前期研究［5］探索了PD-L1在NSCLC組織的表達(dá)情況及其影響因素，尚未發(fā)現(xiàn)PD-L1在NSCLC組織中表達(dá)有明顯規(guī)律性，但發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)與TNM分期存在一定程度的相關(guān)性，為避免這一因素干擾，將研究對(duì)象定義為早期（Ⅰ～Ⅱ期）和Ⅲ～Ⅳ期兩組，探討NSCLC中PD-L1表達(dá)的預(yù)后意義。有體外研究顯示PD-L1能調(diào)節(jié)糖酵解相關(guān)酶類，直接影響腫瘤部位的代謝［6］。本研究旨在進(jìn)一步探索PD-L1表達(dá)與腫瘤組織分子水平代謝活性的反應(yīng)指標(biāo)最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值（maximum standardized uptake value，SUVmax）之間的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2008年4月至2014年8月就診于天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，經(jīng)肺部根治術(shù)及病理明確診斷為NSCLC的122例初治患者相關(guān)臨床影像、病理資料及石蠟標(biāo)本。臨床分期根據(jù)第8版國際肺癌腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumornode-metastasis，TNM）分為：Ⅰ期31例，Ⅱ期32例，Ⅲ期58例，Ⅳ期1例。患者信息通過其術(shù)后就診檢查記錄、信訪、電話隨訪所得，隨訪日期截止至2016年8月30日，隨訪時(shí)間為12～90個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為37個(gè)月，至隨訪結(jié)束30例（24.5%）患者死亡。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 石蠟塊連續(xù)切片，石蠟切片常規(guī)脫蠟，高溫高壓修復(fù)2 min（修復(fù)液pH為9.0的乙二胺四乙酸），3%H2O2溶液封閉；加PD-L1一抗1:400（美國Proteintech公司），4℃冰箱過夜，加二抗增強(qiáng)及二抗，37℃30 min；DAB顯色；蘇木素復(fù)染1～2 min，1%的鹽酸酒精浸泡10 s，水洗5 min。梯度酒精脫水，封片。

1.2.2 結(jié)果判斷 2名病理科醫(yī)生采用盲法判讀結(jié)果。PD-L1染色陽性為腫瘤細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。在高倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，每個(gè)視野至少計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。目前PD-L1陽性表達(dá)尚無明確定義，PD-L1染色結(jié)果判定根據(jù)陽性腫瘤細(xì)胞所占腫瘤細(xì)胞百分比進(jìn)行半定量分析，以陽性細(xì)胞百分比中位數(shù)為界，原發(fā)灶PD-L1分為陰性、低表達(dá)組和高表達(dá)組（圖1）。

1.3 全身18F-FDG PET/CT檢查

患者影像數(shù)據(jù)通過DiscoveryST4 PET/CT掃描儀（美國GE公司）獲取。18F-FDG為pH值5～7，放射化學(xué)純度≥95%的等滲溶液，由天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院分子影像及核醫(yī)學(xué)診療科提供。檢查前患者需禁食6 h以上，且空腹血糖＜6.8 mmol/L，經(jīng)肘前靜脈注射劑量為3.7 MBq/kg～4.81 MBq/kg的顯影劑，平靜休息約60 min后行全身PET/CT顯像，顯影范圍為顱底部至股骨中段，最后由2名以上核醫(yī)學(xué)醫(yī)師將所得圖像行衰減校正及迭代法重建，在放射性核素濃聚灶部位設(shè)置感興趣區(qū)（region of interest，ROI），通過計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算出該區(qū)的SUVmax。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)原發(fā)灶PD-L1表達(dá)（IHC×400）

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。等級(jí)變量相關(guān)性分析采用Spearman法，SUVmax在PD-L1分組中的差異性采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier和Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生存分析

考慮到PD-L1低表達(dá)組和高表達(dá)組例數(shù)少，在早期肺癌患者分析中將其結(jié)合分為陰性、陽性兩組，PDL1陰性組OS較陽性組長（P=0.017，圖2），而Ⅲ～Ⅳ期中兩組OS無顯著差異（P=0.882，圖3）。

圖2 63例NSCLC患者PD-L1表達(dá)陰性與陽性組的預(yù)后

圖3 59例Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者PD-L1表達(dá)陰性與陽性組的預(yù)后

早期NSCLC患者單因素生存分析中，腫瘤最大徑和PD-L1是OS的影響因素（P=0.042，P=0.029），性別、年齡、病理類型、CEA水平和SUVmax分組不是OS影響因素（P＞0.05），PD-L1（HR=4.518，95%CI：1.176～17.352；P=0.028）和腫瘤最大徑（HR=1.404，95%CI：1.020～1.933；P=0.037）均是早期NSCLC患者的獨(dú)立預(yù)后因子（表1）；Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者單因素生存分析中，性別、病理類型、腫瘤最大徑、SUVmax分組是OS的影響因素（P=0.011，P=0.001，P=0.008，P=0.029），年齡、CEA水平、PD-L1對(duì)OS無明顯影響（P＞0.05，表2）。

2.2 PD-L1表達(dá)與SUVmax的相關(guān)性分析

SUVmax根據(jù)ROC曲線計(jì)算界值為10.6，分為低值組≤10.6，高值組＞10.6；PD-L1表達(dá)與SUVmax無相關(guān)性（P=0.880），SUVmax在PD-L1分組中無顯著性差異（表3）。

表1 早期NSCLC患者生存分析

表2 Ⅲ、Ⅳ期NSCLC患者生存分析

表3 PD-L1表達(dá)與SUVmax的相關(guān)性分析

3 討論

前期研究［5］中發(fā)現(xiàn)PD-L1與CD3+T細(xì)胞、淋巴細(xì)胞PD-1以及EGFR基因突變水平無相關(guān)性，原發(fā)病灶與相應(yīng)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)之間的PD-L1表達(dá)水平也無關(guān)聯(lián)。本研究進(jìn)一步分析PD-L1表達(dá)在NSCLC患者預(yù)后的意義，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)是早期NSCLC患者的獨(dú)立預(yù)后因子，尚不能成為Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者生存的預(yù)后相關(guān)因素。

既往相關(guān)研究中對(duì)PD-L1表達(dá)的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值存在爭議：兩項(xiàng)研究［7-8］表明PD-L1過表達(dá)與預(yù)后呈正相關(guān)，兩項(xiàng)研究［9-10］表明PD-L1過表達(dá)與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，還有三項(xiàng)研究［11-13］表明兩者無顯著相關(guān)性。近期發(fā)表的1篇Meta分析［14］共納入15項(xiàng)研究3 116例NSCLC患者來分析PD-L1過表達(dá)與臨床因素及預(yù)后的關(guān)系，其中的亞組分析結(jié)果顯示，PD-L1過表達(dá)與亞洲NSCLC患者OS時(shí)間更短有關(guān)（HR=1.84，95%CI：1.14-2.28；P＜0.001），分析結(jié)果還提示，PD-L1過表達(dá)與分期較晚、腫瘤分化程度低相關(guān)，而與其他臨床因素及EGFR突變情況不相關(guān)。日本的一項(xiàng)研究［15］結(jié)果與此類似，在I期NSCLC中PD-L1表達(dá)的患者預(yù)后更差，而且該研究中PD-L1陽性患者的腫瘤復(fù)發(fā)率幾乎是PD-L1陰性的2倍。由于PD-L1/PD-1信號(hào)通路激活，發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用，使腫瘤局部微環(huán)境T細(xì)胞免疫效應(yīng)降低，誘導(dǎo)T細(xì)胞發(fā)生免疫耐受、甚至凋亡，促進(jìn)T細(xì)胞耗竭，并增強(qiáng)Treg功能，從而介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤發(fā)展［16-18］。這可能是PD-L1陽性患者OS相對(duì)較短，預(yù)后差的原因。PD-L1過表達(dá)不僅在NSCLC患者中提示侵襲性高，預(yù)后差［19］，類似結(jié)論在肝癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中也有報(bào)道［20］。

PD-L1過表達(dá)不能成為分期較晚的NSCLC患者預(yù)后影響因素的原因比較復(fù)雜。首先，PD-L1表達(dá)機(jī)制尚不十分明確，既受腫瘤細(xì)胞基因調(diào)控［21-22］，又可能被過繼性免疫釋放因子如IFN-γ等誘導(dǎo)表達(dá)［23］；其次，TNM分期越晚，患者腫瘤微環(huán)境越復(fù)雜，患者預(yù)后所受影響因素就越多；再次，患者后期接受的治療方案不盡一致，以及納入樣本量較少，PD-L1負(fù)性調(diào)控作用可能不明顯等。

PD-L1作為免疫調(diào)節(jié)蛋白，不僅結(jié)合PD-1向T細(xì)胞發(fā)出抑制信號(hào)，還在腫瘤微環(huán)境中增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞糖酵解速率，耗盡葡萄糖，從而使免疫細(xì)胞處于“饑餓”狀態(tài)［6］。假如腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-L1，促進(jìn)自身糖酵解，從而使腫瘤細(xì)胞攝取更多的“糖”，該環(huán)境可能會(huì)表現(xiàn)出的高水平SUVmax，但本研究結(jié)果證實(shí)，SUVmax與PDL1表達(dá)無相關(guān)性。與Lopci等［24］研究結(jié)果一致。目前相關(guān)研究較少，PD-L1表達(dá)與SUVmax的關(guān)系尚無明確定論，值得進(jìn)一步探索。

本研究中，PD-L1表達(dá)是早期NSCLC患者的獨(dú)立預(yù)后因子，尚不能成為分期較晚的NSCLC患者的預(yù)后因子。雖然NSCLC原發(fā)病灶SUVmax水平和PD-L1表達(dá)相關(guān)性不明顯，但是探索腫瘤微環(huán)境中免疫分子和代謝的關(guān)系，對(duì)更好地認(rèn)識(shí)免疫抑制機(jī)制如何發(fā)揮作用，對(duì)腫瘤預(yù)后和根據(jù)免疫分子制定治療方案有重要的臨床意義。

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